1植入骨钉周围病理组织学检查

　　植入后12周:高倍视野下,生物界面骨螺钉组结果见图1a,局部可见少许炎性细胞浸润,计数<5个,未见巨噬细胞,计数<1个,骨钉周围见薄层纤维结缔组织包绕,厚度<0.05mm:消毒牛骨钉组结果见图1b,局部可见大量炎性细胞浸润,计数>16,<20个,见巨噬细胞计数<5个,骨钉周围见大量纤维结缔组织包绕,厚度>0.2mm,<0.5mm;消毒羊骨钉组结果见图1c,局部可见炎性细胞浸润,计数>10,<15个,见巨噬细胞,计数<5个;骨钉周围见纤维结缔组织包绕,厚度>0.1mm,<0.3mm。

　　置入后24周:高倍视野下,生物界面骨钉组结果见图2a,局部可见少许炎性细胞浸润,计数<5个,未见巨噬细胞,计数<1个,骨钉周围未见明显纤维结缔组织包绕消毒牛骨钉组结果见图2b,局部可见炎性细胞浸润,计数>5个,<10个,见巨噬细胞,计数<3个,骨钉周围见纤维结缔组织包绕,厚度>0.05mm,<02mm;消毒羊骨钉组结果见图2c,局部见少量炎性细胞浸润,计数>3个,<5个,未见巨噬细胞;骨钉周围见纤维结缔组织包绕,厚度<0.02mm。

　　Lane组织学评分的各组数据进行统计学分析,按照生物界面骨螺钉组与消毒牛骨钉组和消毒羊骨钉组,进行随机设计多样本均数的单因素方差分析,结果12周时,差异有显著性意义(F=9536,P<0.01),生物界面骨螺钉组>消毒羊骨钉组>消毒牛骨钉组。而两组消毒钉组的评分差异无显著性意义;24周时,差异有显著性意义(F=34.299,P<0.01),生物界面骨螺钉组>消毒羊骨钉组>消毒牛骨钉组。

　　2界面应力载荷及界面刚度的测试将初始界面应力载荷的各组数据,进行随机设计多样本均数的单因素方差分析,生物界面骨螺钉组与消毒牛骨钉组和消毒羊骨钉组比较,差异无显著性意义(F=215,P>0.05),各组初始最大界面载荷基本相等;12周时,3组比较差异有显著性意义(F=5374,P<005),生物界面骨螺钉

　　1材料和方法

　　设计:动物实验,生物力学测试

　　时间及地点:于200902/201004在广州联勤部157医院动物实验室完成。

　　材料:健康中国山羊18只,约18月龄,体质量15-18kg,雌雄不限,清洁级,由广东冠吴生物有限公司实验动物中心提供,用于螺钉植入实验,实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。健康湖区水牛的胫骨及健康广东山羊的股骨根据实验需求批次来定,购买于广州燕塘畜牧公司,取皮质骨部用于实验。

　　方法

　　植入螺钉的制备:

　　牛皮质骨生物界面螺钉:①取成年健康湖区水牛的胫骨。②皮质骨部预处理:进行消毒除杂质、机械切割成型等,制成6.0mmx25mm的界面皮质骨螺钉若干枚。③脱脂:用有机溶剂抽提动物骨内部的脂肪杂质。④脱细胞:用表面活性剂或者蛋白酶脱除其中的细胞。⑤固定处理:用环氧化物作为交联固定剂将材料中的骨胶原进行交联固定。⑥多方位除抗原:多种试剂破坏或封闭抗原表位。⑦朊病毒杀灭:杀灭可能存在的朊病毒。⑧诱导活性修饰:将可黏附生长因子及细胞的活性组分,引入生物骨表面。⑨包装。①y射线辐射灭菌。

　　牛皮质骨消毒界面骨螺钉(消毒牛骨钉):取成年健康湖区水牛的胫骨皮质骨部,去除骨髓骨膜及软组织,在洁净条件下以数控机床铣磨呈实验松质骨骨螺钉规格,制备若干枚。体积分数75%乙醇浸泡6h,干燥后无菌包装,-20℃深低温冷冻,备用。使用前2h自然解冻。

　　羊皮质骨消毒界面骨螺钉(消毒羊骨钉):取健康广东山羊的股骨近端皮质骨,制作过程同牛皮质骨消毒钉。

　　植入骨钉方法:18只健康中国山羊随机数字表法分为3组,分别植入生物界面骨螺钉、消毒牛骨钉、消毒羊骨钉。植入前前禁食10h,先选后左后肢一侧股骨中段为术区,常规备皮。前肢静脉置管,滴注平衡液500mL+氯安酮10mgkg全麻。羊取侧卧位,气管插管,左侧后肢向上。常规碘酒、乙醇消毒,铺无菌巾。于实验羊右后肢胫骨外侧纵向恰开皮肤约2cm,依次切开皮下,筋膜至骨质。于胫骨平台下1cm,冠状位由外向内用直径60mm电钻钻孔,至穿出对侧皮质,测深器探查骨道四壁均位于松质骨内后,拧入60mmx25mm生物界面骨螺钉1枚,止血后依次缝合各层,无菌辅料包扎。同法于右股骨髁部、左胫骨髁部相同位置拧入同组骨螺钉1枚。其余2组分别植入消毒牛骨钉和消毒羊骨钉。

　　病理组织学观察:3组骨螺钉组于植入后12,24周取出实验羊右后肢股骨的螺钉,切片部位为骨螺钉与松质骨接触界面的横切面,每一标本随即抽取3点。显微镜观察骨质的疏松变化,炎症细胞的浸润,骨钉内有无破骨细胞存在,以及纤维组织增生、包绕的情况。按Lane- Sandhu组织学评分标准进行评分界面应力载荷及界面刚度的测试:3组于置入后12,24周随机处死实验羊各3只,立刻取出双侧胫骨髁部,去除附着软组织、韧带及肌肉,将髁部适宣切割、塑形,以骨质内的松质骨骨螺钉为中心,切除不规则骨质,清除胫骨髁骨道内松质骨骨螺钉前后的增生组织及骨碎屑。-20℃低温保存,备用。实验前2h去除标本常温下解冻。在国产瑞格尔-10型生物力学实验机上进行生物力学测定。自凝牙托粉包埋骨质部,使其骨质部适宜被台钳固定,且松质骨骨螺钉在骨道内垂直于水平面。将台钳固定于力学实验机底座上,取直径7mm的金属棒插入松质骨骨螺钉头端的骨道中,金属棒上端骨钉与力学实验机的横臂上。反向推顶松质骨骨螺钉,测量推出该钉的最大破坏力,即为最大界面应力载荷。并测量加载的位移,即界面刚度。每次测试前均进行3次共60s的预加载,以消除标本松弛,蠕变等影响因素。每一标本在测试结束将实验机器归零后测试下一标本。实验采用连续加载方式,加载速度10mmmn,分别由计算机记录螺钉的最大界面应力载荷及刚度初始指标测定:取消毒羊松质骨块,用直径6mm电钻钻穿骨块,将生物界面骨螺钉、消毒牛骨钉及消毒羊骨钉各6枚,分别植入骨块中,同上法测量初始的最大界面应力载荷及压缩刚度。

　　主要观察指标:病理组织学检查观察不同工艺处理过的骨螺钉与宿主骨不同时间窗内界面细胞的组成、纤维化的程度,评价骨钉植入引起宿主免疫排斥反应的强度。而该反应的强度又会直接导致不同方式的界面骨连接方式,以及由此产生的界面力学性能的差异统计学分析:由第一作者采用SPSs130单因素方差分析,统计软件由广州医学院医学统计教研室提供。

　　2.1植入骨钉周围病理组织学检查

　　植入后12周:高倍视野下,生物界面骨螺钉组结果见图1a,局部可见少许炎性细胞浸润,计数<5个,未见巨噬细胞,计数<1个,骨钉周围见薄层纤维结缔组织包绕,厚度<0.05mm:消毒牛骨钉组结果见图1b,局部可见大量炎性细胞浸润,计数>16,<20个,见巨噬细胞,计数<5个,骨钉周围见大量纤维结缔组织包绕,厚度>0.2mm,<0.5mm;消毒羊骨钉组结果见图1c,局部可见炎性细胞浸润,计数>10,<15个,见巨噬细胞,计数<5个;骨钉周围见纤维结缔组织包绕,厚度>0.1mm,0.3mm。

　　置入后24周:高倍视野下,生物界面骨钉组结果见图2a,局部可见少许炎性细胞浸润,计数<5个,未见巨噬细胞,计数<1个,骨钉周围未见明显纤维结缔组织包绕;消毒牛骨钉组结果见图2b,局部可见炎性细胞浸润,计数>5个,<10个,见巨噬细胞,计数<3个,骨钉周围见纤维结缔组织包绕,厚度>0.05mm,<0.2mm:消毒羊骨钉组结果见图2c,局部见少量炎性细胞浸润,计数>3个,<5个,未见巨噬细胞:骨钉周围见纤维结缔组织。

　　Lane组织学评分的各组数据进行统计学分析,按照生物界面骨螺钉组与消毒牛骨钉组和消毒羊骨钉组,进行随机设计多样本均数的单因素方差分析,结果12周时,差异有显著性意义(F=9536,P<001),生物界面骨螺钉组>消毒羊骨钉组>消毒牛骨钉组。而两组消毒钉组的评分差异无显著性意义:24周时,差异有显著性意义(F=34299,P<0.01),生物界面骨螺钉组>消毒羊骨钉组>消毒牛骨钉组。

　　2. ,2界面应力载荷及界面刚度的测试将初始界面应力载荷的各组数据,进行随机设计多样本均数的单因素方差分析,生物界面骨螺钉组与消毒牛骨钉组和消毒羊骨钉组比较,差异无显著性意义(F=2.15,P>0.05),各组初始最大界面载荷基本相等;12周时,3组比较差异有显著性意义(F=5374,P<0.05),生物界面骨螺钉组>消毒牛羊骨钉组,而二消毒钉组的最大载荷基本相同:24周时,3组比较差异有非常显著性意义(F=1323,P<0.01),两两比较,均有比较明显的差异,实验界面骨钉组>消毒羊骨钉组>消毒牛骨钉组。

　　将初始界面刚度各组数据,进行随机设计多样本均数的单因素方差分析,生物界面骨螺钉组与消毒牛骨钉组和消毒羊骨钉组比较,差异无显著性意义(F=0688,P>0.05),各组初始界面刚度本相等;12周时,3组比较,差异有显著性意义(=7285,P<0.01,生物界面骨螺钉组>消毒牛骨钉组;24周时,3组比较,差异有显著性意义(F=27235,P<001),24周时各组间差异更大,生物界面骨螺钉组>消毒羊骨钉组>消毒牛骨钉组。

　　3讨论

　　由上实验可见,随着植入时间的延长,生物界面骨螺钉组对宿主骨组织产生的免疫炎性反应最小,纤维化程度最低,被吸收、改建最严重,界面成骨能力最强。在12周,两组消毒钉组的各项指标相近,但免疫炎性反应明显强于生物界面骨螺钉组。24周时,消毒羊骨钉组界面成骨能力较消毒牛骨钉明显增强。在初始的界面应力载荷与刚度中各组螺钉没有明显差别,说明通过去除抗原的一系列处理后,生物界面骨螺钉的生物力学没有明显下降;12周,各组的最大载荷及界面刚度均有一定增强,而生物界面骨螺钉组明显强于其他二组;24周各组最大界面应力载荷均有增大,生物界面骨螺钉组最大,消毒牛骨钉组最小,羊骨钉组居中;界面刚度则实验及消毒羊骨钉组较12周增大,而消毒牛骨钉组则没有明显增强,还有减弱的趋势。可见随着植入时间的延长,生物界面骨螺钉的生物力学性能明显增强,作为同种异体骨的消毒羊骨钉也有一定程度的增强,略弱于生物界面骨螺钉。而消毒牛骨钉的生物力学性能有减弱趋势。宿主的新骨将植入骨包绕穿插称为骨掺入,骨掺入过程中来自宿主的新骨有两个细胞来源:一是来自宿主植床周边中的定向成骨细胞前体细胞(DOCP),它们通过增殖延伸至植入骨及其腔隙表面,产生成骨细胞,生成新骨,这种成骨方式也就是骨传导;二是植入物周边的结缔组织中可诱导成骨前体细胞(ocP),它们在诱导因子如BMP的作用下可被诱导为定向成骨细胞而形成新骨,这就是骨诱导8。而Bue在1985年提出,任何具有增殖潜力的结缔组织细胞都具有分化为骨组织的能力可见,植入皮质骨钉周围的炎性结缔组织的包裹也是其被吸收、改建的过程之一同。本实验的病理组织切片中,生物界面骨螺钉组在纤维结缔组织层里找到了大量破骨细胞,数量明显多于其他两组。

　　消毒牛骨钉组较之实验生物骨钉组严重的纤维化则不同于骨诱导的掺入过程。异种皮质骨的天然异种抗原主要是q-半乳糖基抗原(aGa,刘玮等用免疫组织化学方法证实了牛骨移植抗原定位于骨细胞和哈佛管内皮上未进行去抗原处理的皮质骨界面骨钉植入后,发生免疫排斥反应,移植骨与受区的连接区内,毛细血管的阻塞和血管周围组织的浸润,称之为延迟过敏性反应。随着延迟过敏性反应的消退,血管床被受区和供体之间形成的瘢痕纤维组织所替代,而纤维瘢痕的厚度与延迟性过敏反应的强度是成正比的。这种过度的纤维化也导致了消毒钉组力学性能的下降。由于免疫原就在骨板包绕的哈佛氏管壁上,在骨材料的吸收改建中,这些抗原物质被一层层的、逐渐的暴露于宿主内环境中。因此这种免疫原性炎症反应所形成的纤维连接会贯穿于骨材料吸收改建的始终。

　　界面应力也称界面剪切应力,反映螺钉在松质骨内产生的单位摩擦力的大小。其计算公式为y=PmDh,式中P为载荷,D为试件骨螺纹直径,h为试件高度。而我们测量到的直接最大推载荷就是P,也就是界面应力载荷。去除螺钉弹性模量的影响,测得的界面应力载荷也可理解为螺钉的最大拔出力1間。螺钉拔出力主要来源于其与松质骨间的摩擦力,松质骨中骨小梁走向,对螺钉拔出力的影响举足轻重因而本实验的力学模型建立时,所有的界面骨钉均与骨干长轴垂直,使得接触螺钉的松质骨骨小梁方向相同,以减少系统误差。此外,拔出力又与松质骨的表观密度即单位体积松质骨的质量有关1。 Cater等通过研究松质骨纵向压缩强度(s)弹性模量(E)与表观密度(P)之间的相互关系,得出:s=06800603E=3790c00602,充分说明松质骨的骨密度对螺钉松质骨界面摩擦力影响较大,如上公式:螺钉抗拔力与松质骨密度呈正比。因此,内固定物周围骨质的质量变化会影响内固定生物力学的表现四2。相反,如果植入的内固定物能影响了周围骨组织的形成和改建,也就能影响自身的力学性能。这种能力也是生物皮质骨材料所特有的。

　　骨内种植体的治疗主要依靠种植体与骨组织的直接结合。虽然尚缺乏确凿的理论数据支持,人们通常认为种植体与周围骨组织结合程度愈高,对功能预后愈好。骨界面应力分布状况通过组织病理学观察发现,消毒牛骨钉刺激周围组织明显的组织纤维化,这种免疫炎性反应导致的是界面间的纤维性连接阿。而通过去抗原处理的界面骨钉和同种异体骨则没有明显的纤维化。最近一个医疗机构在对颈椎植骨融合机械性失败的临床观察发现,在不同的植骨材料中,因为纤维化的存在异种皮质骨丧失了机械性能而导致植骨失败。只是个例子,但可说明,未经去抗原处理的牛皮质骨钉在实验羊上产生的纤维化同样是一个不良的临床效应22尽管牛骨的这种成纤维化反应也是其能在椎间植骨中应用的原因之2930。此外作者在去抗原处理后的骨螺钉组织学观察中发现,其破骨细胞较其他两组多,这也解释了为什么在大体观察中,生物界面骨螺钉的表面螺纹及螺柱破坏最严重。可见成骨效应不仅仅是导致螺纹出现凹槽而增大了骨钉与周围骨质的物理接触面积,而是在与周围松质骨的界面间发生了骨性连接,越高的推力载荷也就是越高的骨融合的能力及程度。相反,免疫排斥反应不仅阻碍了成骨,也使得植入物与宿主间产生大量纤维连接,从而降低了界面应力。本实验表明,对牛骨处理方式的差异直接导致了两组牛皮质骨钉抗原抗体免疫性反应上的差异性。免疫排斥反应又能够抑制骨的塑性及改造,降低植入物的生物力学性能,从而出现了3组骨钉生物力学性能差异有显著性意义。生物骨钉的初始力学性能不低于消毒牛骨,且能较长时间保持稳定的力学性能;生物骨钉具有一定的成骨作用,与宿主骨组织结合后,产生更强的界面应力。