摘要:目的了解福建口岸汉坦病毒的基因型别和分子特征。方法对2010年福建口岸捕获的鼠形动物进行汉坦病毒检测,对部分阳性标本进行M基因片段序列分析。结果2010年福建口岸共捕获鼠形动物839只,以褐家鼠为优势鼠种,占58.52%;鼠形动物携带汉坦病毒阳性率584%,均为汉城型(SEO),阳性鼠种为褐家鼠和黄胸鼠,阳性率分别为896%和309%。汉坦病毒检出呈较明显的冬春季高峰。用M基因片段(nt2001~2301)核苷酸序列构建系统进化树,将福建口岸SEO分为S2和S3两个亚型。结论S3亚型SEOV为福建口岸优势流行亚型。

　　汉坦病毒( Hantavirus,HV)属布尼亚病毒科( Bunyaviridae)汉坦病毒属,为分节段的单股负链RNA病毒,到目前已发现的HV基因型超过30种12),每型来自一种或几种密切相关的鼠形动物,并在宿主中产生无症状感染,与自然宿主共进化33。福建省属肾综合征出血热( hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)低流行省,但近年来疫情报告显示HFBS疫情似有升高趋势6。为了解HFRS在福建口岸流行情况,我们对2010年口岸鼠形动物监测标本进行HV核酸检测和基因序列分析,为福建口岸HFRS防治提供参考。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1标本2010年1-12月在福建主要口岸应用笼夜法捕获鼠形动物,记录其捕获日期、地点、生境、种类、性别,无菌解剖取鼠肺,置-80℃冰箱保存。

　　1.1.2主要试剂 Rnase Inhibitor、 AMv ReverseTranscriptase、 Ex Taq、 DNA Marker为宝生物工程(大连)有限公司产品, EZI Virus mini kit、胶回收试剂盒为 Qiagen公司产品。

　　1.2HV核酸检测及序列分析

　　1.2.1鼠肺中总RNA的提取取约100mg鼠肺置于组织研磨器中,加入预冷1 ml Hank's液冰上研磨,4℃3000×g离心5min,取100μ上清液,用 QIAGENEZ1核酸工作站提取总RNA,溶于75μ I DEPCH2O,-80℃保存备用1.22HⅤ核酸检测引物参考《全国肾综合征出血热监测方案》,由生工生物工程(上海)有限公司合成。根据该方案进行RT-PCR和巢式PCR扩增,扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳,根据条带分子质量大小鉴定并判定型别。

　　1.2.3基因测序及序列分析取部分扩增产物切胶回收,送生工生物工程(上海)有限公司进行测序,选取Genbank中HV相应序列为参考株,用 DNAStar、 ClustalXMega软件进行序列分析并构建系统进化树。

　　2结果

　　2.1鼠形动物携带HV监测

　　2.1.1鼠形动物及带病毒率2010年福建口岸共捕获鼠形动物839只,以褐家鼠( Rattus norvegicus)为优势鼠种,占捕获总数的5852%。检出携带HV鼠形动物样本49份,均为汉城型(SEO),带病毒率为584%。携带HV鼠种为褐家鼠和黄胸鼠(R. tanezumi),其中褐家鼠阳性44份,阳性率为896%;黄胸鼠阳性5份,阳性率为309%(表1)。

　　2.1.2季节分布2010年检出HV阳性样本中,冬季(11月至翌年1月)阳性样本共25份,占51.0%,春季(2-4月)阳性样本共12份,占24.5%,冬春季阳性样本占总阳性样本的755%(表2)。

　　2.1.3地区分布2010年福州地区(马尾、福清)共检出阳性样本36份,检出HV占总阳性数的735%;宁德口岸检出阳性7份,占14.3%(表3)。22M基因片段序列分析对其中24份标本扩增产物(马尾口岸13份,福清口岸6份,宁德口岸3份,晋江口岸1份,石狮口岸1份)进行测序,用 DNAStar的MegAlign模块,采用 Jotun Hein法与 Gen bank中SEOVM基因序列进行比较分析:福建口岸SEOV株间同源性为940%~100.0%;福州地区(马尾及福清口岸)SEOⅤ株间同源性较高,为960%~10%。福建口岸SEOⅴ与SEoⅤ参考株AF035833(L99株)和S68035(R22株)同源性分别为937%~953%和92.0%~937%;与汉滩型病毒(HTNV)参考株M14627(76-118株)同源性为71.1%~72.4%。用所测M基因片段序列(nt2001~2301)与Gen Bank中 SEOV M基因相应序列构建系统进化树(图1):2株病毒10395(马尾)和10036(晋江)在S2亚型分支,与S2参考株亚型(AY645717等)同源性为970%~97.7%;其余SEOV均属于S3亚型,与S3亚型参考株(DQ133505、AB027092等)同源性为940%~97%。

　　3讨论

　　传统上以19℃等温线为界将福建省HFRS疫源地分为2种类型,北部为褐家鼠、黄毛鼠(R. losea)、黑线姬鼠( Apodemus agrarius)混合型疫源地,南部为褐家鼠、黄胸鼠家鼠型疫源地印,但近年来福建省HFRS流行以家鼠型为主。监测结果显示,除莆田口岸外,其余各口岸均检出HV,其中福州口岸检出HV占阳性总数的735%,宁德口岸占14.3%,两个地区人间HFRS疫情也位居福建省前列。49份HV核酸阳性的鼠肺样本均为SEOV,其中褐家鼠样本44份,占总阳性数的89.8%,说明褐家鼠是福建口岸HV主要宿主动物和传染源,与福建省鼠间HFRS监测结果一致。HV季节图1M基因片段(nt2001~2301)核苷酸序列系统进化树Fig. 1 Phylogenetic tree of partial M segment(nt2001-2301)sequences分布呈冬春季高峰,占全年阳性样本的75.5%,其中冬季检出阳性样本占全年检出数的51.0%,明显高于春季,与福建地区人间HFRS监测结果基本一致。由于鼠形动物携带HV季节分布和地区分布与人间疫情基本相符,因此,监测鼠间HFRS的流行,可预测人间HFRS动态。

　　为更好地了解福建口岸鼠形动物携带HV流行的类型,对福建口岸SEOⅤV进行核苷酸序列同源性及系统进化树比较分析,结果显示口岸地区所检出SEOv以S3亚型为主,可能是福建口岸地区的优势流行亚型。HⅣ基因型具有小范围的地理聚集现象3),本研究中福州口岸18株S3亚型HV株间同源性为96.7%~100%,与DQ133505(北京)和GU592931(浙江)的亲缘关系较近,同源性分别为973%~993%和977%~99.3%,与其他S3亚型参考株核苷酸同源性为944%~98.3%,序列分析结果表明同一地区病毒核苷酸序列同源性较高,在系统进化树上聚集在同一分支显示出地理聚集特点。

　　本研究利用RT-PCR扩增HV基因部分M片段核苷酸序列,从分子流行病学角度证实福建口岸HV在鼠形动物中流行情况及其基因型和亚型。随着全球化和国际交通迅猛发展,原来区域性传染病可以快速播散至全球。HV的基因重组已有报道,由于HV与宿主共进化,随着生态环境的变化,宿主动物改变和新发宿主迁移,可能会引起HⅣ变异或基因重组3,给诊断和防治带来困难。因此卫生检疫部门应加强对入境交通工具、货物及旅客检疫查验,防止境外流行株传入或与国内流行株产生混合变种的机会,避免对未经适应的人类宿主产生更强烈的攻击;同时,加强对口岸地区特别是鼠间HFRS高发地区宿主动物监测,分析疫情动态和发展趋势,为疫情预测预报及制定防制对策提供科学依据。