啮齿类动物腭裂动物模型的研究现状
来源：未知 |发布时间：2018-05-09 09:25|点击:次
腭裂动物模型在病因学、形成机制及治疗方法等研究中具有重要的作用。自 Carol首次通过手术方法建立恒河猴槽嵴裂动物模型以来,已制备了多种腭裂动物模型。近年来在利用转基因和基因敲除技术制备基因特异的腭裂动物模型方面有了很大进展。本文就腭裂动物模型的分类、建立、应用及评价等方面的研究现状作一综述。
1.动物模型的分类
应用于唇腭裂研究的动物模型,按产生的方法不同,主要分为两类:一类是外科手术诱导的动物模型,多用于腭裂临床治疗方法的探索;另一类是先天性唇腭裂动物模型,主要用于腭裂病因学和发生机制方面的研究。本文着重对先天性唇腭裂动物模型加以讨论。
1.1外科手术诱导的动物模型
这类动物模型是采用外科手术方法,在唇、牙槽嵴、硬腭或软腭上人为形成一条裂隙,以模拟唇腭裂;或者不形成裂隙,仅模拟唇膊裂治疗中某现象,如在动物腭部形成类矩形黏骨膜缺损,以模拟朗根贝克切断术造成的腭裸露骨创面。前者称为有裂模型,后者称为非裂模型。这种模型通常采用狗、兔猫、灵长类动物和大鼠为研究对象。
1.2先天性唇腭裂动物模型
此类动物模型是在特定奸娠时期给予母体动物某些致畸剂,诱导胎儿或产后幼仔的先天性腭裂;或者由筛选出自发率高的特定种系的动物自然产出先天性腭裂幼仔。通常采用啮齿类动物作为模型动物,大动物如猴、羊、狗等。另外,此类中还包括采用转基因或基因敲除技术所建立的鹏裂动物模型。
2动物模型的建立
2.1啮齿类动物
已用于建立先天性腭裂模型的啮齿类动物有小鼠、大鼠和仓鼠。啮齿类动物模型又可分为自发和诱发两类。传统的近交系小鼠A/JCL/Fr品系具有自发唇裂倾向,自发率分别为8%~10%和18%~26%。TIWh小鼠能自然发生腾裂,发生率为35%。近年来培育的A/WySn小鼠自发产生膊裂可达20%。通过致畸剂的诱导,小鼠唇腭裂发生率可有效增强。视黄酸( retinoic acid,RA)是一种常见的致畸原, Kochhar等已经应用RA诱导鼠腭裂的发生。RA诱导腭裂可因动物种系、给药时间、给药剂量以及RA溶媒剂的不同而有差异,并在胚胎同一发育阶段诱导腭裂的发生率和致畸程度随给药剂量的增加而增高,呈剂量反应关系当剂量增加到一定程度时则引起流产、死胎和胚胎吸收。
研究表明在第8、10、12天给予RA均能引起鼠胚腭裂的发生,但是发生率却有所不同。如以相同剂量的RA在孕鼠妊娠第10天给药,膊裂的发生率为100%,而在第12天给药其腭裂发生率仅为42%。苯妥英钠可使A/J小鼠唇裂发生率提高到100%,6-氨基尼克酰胺使CL/Fr小鼠唇裂发生率增加到94%。在醋酸可的松诱导下,TIWh小鼠腭裂发生率上升到657%。在A/J小鼠妊娠11~14d,给予醋酸可的松,可诱导出该鼠腭裂。妊娠14d后,给予200mg/kg甲基苄肼,可诱导 Wistar大鼠产生腭裂門。仓鼠在妊娠第10天受到6-氨基丙腈诱导可出现腭裂。
2.2猴
用环磷酰胺可诱导出猴的先天性唇腭裂模型。其方法是于妊娠第27-29天肌注环磷酰胺510mg/kg,给药前1h给予异烟肼25mg/kg以增强致畸作用。所诱导的唇和(或)腭裂的发生率为42.9%
2.3羊
Weinzweig等呵用含六氢吡啶生物碱的烟草属植物,制成半流食,管饲给予妊娠32-41d的羊,每日2次,诱导的完全性腭裂发生率可达97%。
2.4狗
在研究有肌萎缩显性遗传特征的 Brittany西班牙猎狗时,发现此种狗子代偶发腭裂。经遗传分离,获得了具有常染色体隐性遗传特征的先天性腭裂狗,其发生率达269%。 Nasum等國也发现纯种猎兔狗有1.1%的腭裂自然发生率。
2.5转基因动物模型
转基因技术的发展为建立腭裂动物模型提供了新的技术手段。在过去10年间通过基因插入和基因敲除技术建立了20多种转基因唇腭裂动物模型,这为研究基因在腭裂中的功能提供了有力的手段。确定一种基因是否为腭裂的强候选基因必需具备以下两个条件:①转基因/基因敲除导致小鼠腭裂表型出现;②它必须在腭发育的关键时刻在腭相关的组织中表达(表1)。迄今为止,Msx1和Tgf-β3基因蔽除小鼠是最为成功的典范。Msx1基因敲除小鼠腭裂的发生率为100%,且表达于包括腭板在内的正在发育的颌面结构中。在人4p-综合征中有Msx1的缺失,常有面裂的发生:0。Tgfβ3基因敲除小鼠会导致腭裂的发生,研究表明Tg-B3在即将融合前腭突的MEE细胞中进行表达,在中线上皮缝形成之后极短的时间内表达停上間1。Tgf-B3具有刺激和迁移活性,当其活性增加时,产生上皮中间缝的破坏,它通过上皮细胞迁移至三角区和口鼻侧表面或者通过上皮-间充质转化得以实现1。所以Tgf-B3在双侧腭板融合时,通过刺激中间嵴上皮细胞的粘连,在上皮缝的形成和消失中发挥重要的作用。
3动物模型的应用及评价
用于腭裂研究的动物模型主要应用于腭裂畸形的胚胎学及病因学腭裂修补术对颌面生长的影响,以及腭裂宫内修补等方面的研究。对于胚胎学和病因学研究而言,由于小鼠获得容易、饲养方便、产仔率较高,且其基因序列与人类高度同源(99%)。所以公认为是胚胎学及病因学研究合适的动物模型。但涉及颌面生长方面的研究时,存在些争议,一般认为,先天性大动物模型是理想的模型。然而,建立这样的模型不仅耗时、费用高、效果也不稳定。
转基因动物和基因敲除动物模型的方法,其优点是可以将基因与表现联系起来,即从已知基因入手,通过观察表型揭示该基因的功能。通过该系统已鉴定了许多重要的腭裂发育相关基因但却存在以下不足:①基因敲除和插入突变易导致胚胎死亡;②无效突变体实验中,因为隐性纯合子仅占同窝仔鼠的25%,获得有统计学意义的数据很困难;③相关基因的功能丰余性使研究结果的解释复杂化;④所研究基因只能是已知基因而且数量有限;⑤实验周期长,所需设备价格昂贵。自发性腭裂动物模型自发率一般较低,实验样本获得困难,这些都制约了腭裂发生机制的研究。通过给予化学物诱导先天性膊裂,可以通过选取不同的化学物控制腭裂的发生率,取样时间也相对不受控制。而且实验周期短、费用低,摒弃了转基因异常发育动物模型及临床畸胎等实验对象难以获得的弊端,是研究腭裂病因学、发生机制的良好动物模型。
1.动物模型的分类
应用于唇腭裂研究的动物模型,按产生的方法不同,主要分为两类:一类是外科手术诱导的动物模型,多用于腭裂临床治疗方法的探索;另一类是先天性唇腭裂动物模型,主要用于腭裂病因学和发生机制方面的研究。本文着重对先天性唇腭裂动物模型加以讨论。
1.1外科手术诱导的动物模型
这类动物模型是采用外科手术方法,在唇、牙槽嵴、硬腭或软腭上人为形成一条裂隙,以模拟唇腭裂;或者不形成裂隙,仅模拟唇膊裂治疗中某现象,如在动物腭部形成类矩形黏骨膜缺损,以模拟朗根贝克切断术造成的腭裸露骨创面。前者称为有裂模型,后者称为非裂模型。这种模型通常采用狗、兔猫、灵长类动物和大鼠为研究对象。
1.2先天性唇腭裂动物模型
此类动物模型是在特定奸娠时期给予母体动物某些致畸剂,诱导胎儿或产后幼仔的先天性腭裂;或者由筛选出自发率高的特定种系的动物自然产出先天性腭裂幼仔。通常采用啮齿类动物作为模型动物,大动物如猴、羊、狗等。另外,此类中还包括采用转基因或基因敲除技术所建立的鹏裂动物模型。
2动物模型的建立
2.1啮齿类动物
已用于建立先天性腭裂模型的啮齿类动物有小鼠、大鼠和仓鼠。啮齿类动物模型又可分为自发和诱发两类。传统的近交系小鼠A/JCL/Fr品系具有自发唇裂倾向,自发率分别为8%~10%和18%~26%。TIWh小鼠能自然发生腾裂,发生率为35%。近年来培育的A/WySn小鼠自发产生膊裂可达20%。通过致畸剂的诱导,小鼠唇腭裂发生率可有效增强。视黄酸( retinoic acid,RA)是一种常见的致畸原, Kochhar等已经应用RA诱导鼠腭裂的发生。RA诱导腭裂可因动物种系、给药时间、给药剂量以及RA溶媒剂的不同而有差异,并在胚胎同一发育阶段诱导腭裂的发生率和致畸程度随给药剂量的增加而增高,呈剂量反应关系当剂量增加到一定程度时则引起流产、死胎和胚胎吸收。
研究表明在第8、10、12天给予RA均能引起鼠胚腭裂的发生,但是发生率却有所不同。如以相同剂量的RA在孕鼠妊娠第10天给药,膊裂的发生率为100%,而在第12天给药其腭裂发生率仅为42%。苯妥英钠可使A/J小鼠唇裂发生率提高到100%,6-氨基尼克酰胺使CL/Fr小鼠唇裂发生率增加到94%。在醋酸可的松诱导下,TIWh小鼠腭裂发生率上升到657%。在A/J小鼠妊娠11~14d,给予醋酸可的松,可诱导出该鼠腭裂。妊娠14d后,给予200mg/kg甲基苄肼,可诱导 Wistar大鼠产生腭裂門。仓鼠在妊娠第10天受到6-氨基丙腈诱导可出现腭裂。
2.2猴
用环磷酰胺可诱导出猴的先天性唇腭裂模型。其方法是于妊娠第27-29天肌注环磷酰胺510mg/kg,给药前1h给予异烟肼25mg/kg以增强致畸作用。所诱导的唇和(或)腭裂的发生率为42.9%
2.3羊
Weinzweig等呵用含六氢吡啶生物碱的烟草属植物,制成半流食,管饲给予妊娠32-41d的羊,每日2次,诱导的完全性腭裂发生率可达97%。
2.4狗
在研究有肌萎缩显性遗传特征的 Brittany西班牙猎狗时,发现此种狗子代偶发腭裂。经遗传分离,获得了具有常染色体隐性遗传特征的先天性腭裂狗,其发生率达269%。 Nasum等國也发现纯种猎兔狗有1.1%的腭裂自然发生率。
2.5转基因动物模型
转基因技术的发展为建立腭裂动物模型提供了新的技术手段。在过去10年间通过基因插入和基因敲除技术建立了20多种转基因唇腭裂动物模型,这为研究基因在腭裂中的功能提供了有力的手段。确定一种基因是否为腭裂的强候选基因必需具备以下两个条件:①转基因/基因敲除导致小鼠腭裂表型出现;②它必须在腭发育的关键时刻在腭相关的组织中表达(表1)。迄今为止,Msx1和Tgf-β3基因蔽除小鼠是最为成功的典范。Msx1基因敲除小鼠腭裂的发生率为100%,且表达于包括腭板在内的正在发育的颌面结构中。在人4p-综合征中有Msx1的缺失,常有面裂的发生:0。Tgfβ3基因敲除小鼠会导致腭裂的发生,研究表明Tg-B3在即将融合前腭突的MEE细胞中进行表达,在中线上皮缝形成之后极短的时间内表达停上間1。Tgf-B3具有刺激和迁移活性,当其活性增加时,产生上皮中间缝的破坏,它通过上皮细胞迁移至三角区和口鼻侧表面或者通过上皮-间充质转化得以实现1。所以Tgf-B3在双侧腭板融合时,通过刺激中间嵴上皮细胞的粘连,在上皮缝的形成和消失中发挥重要的作用。
用于腭裂研究的动物模型主要应用于腭裂畸形的胚胎学及病因学腭裂修补术对颌面生长的影响,以及腭裂宫内修补等方面的研究。对于胚胎学和病因学研究而言,由于小鼠获得容易、饲养方便、产仔率较高,且其基因序列与人类高度同源(99%)。所以公认为是胚胎学及病因学研究合适的动物模型。但涉及颌面生长方面的研究时,存在些争议,一般认为,先天性大动物模型是理想的模型。然而,建立这样的模型不仅耗时、费用高、效果也不稳定。
转基因动物和基因敲除动物模型的方法,其优点是可以将基因与表现联系起来,即从已知基因入手,通过观察表型揭示该基因的功能。通过该系统已鉴定了许多重要的腭裂发育相关基因但却存在以下不足:①基因敲除和插入突变易导致胚胎死亡;②无效突变体实验中,因为隐性纯合子仅占同窝仔鼠的25%,获得有统计学意义的数据很困难;③相关基因的功能丰余性使研究结果的解释复杂化;④所研究基因只能是已知基因而且数量有限;⑤实验周期长,所需设备价格昂贵。自发性腭裂动物模型自发率一般较低,实验样本获得困难,这些都制约了腭裂发生机制的研究。通过给予化学物诱导先天性膊裂,可以通过选取不同的化学物控制腭裂的发生率,取样时间也相对不受控制。而且实验周期短、费用低,摒弃了转基因异常发育动物模型及临床畸胎等实验对象难以获得的弊端,是研究腭裂病因学、发生机制的良好动物模型。
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