内蒙古草原五种啮齿动物肾脏形态学特征比较
来源：未知 |发布时间：2018-05-08 09:35|点击:次
生活于干旱、半干旱地区的哺乳动物面临着高温、缺水和食物短缺等因素的挑战,其中水分缺乏通常被认为是限制动物生存与分布的主要因素(LouW,1993)。动物进化出了多种行为或生理策略( Coleman and downs,2009)来应对缺水的环境条件,行为上如选择在黎明或黄昏活动、夜行性和穴居等( Louw and Seely,1982; Oswald,1998),生理上如增强肾脏浓缩尿液能力、减少呼吸失水以及最大程度地从食物中获得预成水和增加代谢水Willmer et al., 2005: Coleman and Downs, 2009)。
陆生哺乳动物可通过肾脏重吸收原尿中水分来控制尿液的多少和渗透压,进而调节体液的浓度和体积,维持体内水分平衡(Al- kahtani et al.,2004: Willmer, 2005: schimidt-nilsen and SchimidtNilsen,2011)。当水分摄入量很低时,为减少随代谢废物流失的水分,动物会产生高渗透压尿液(Al- ahtani et al.,2004)。这种浓缩尿液的能力,依赖于肾脏中亨氏小管的构造及其组织学特性,以及细胞生物学作用,如管壁对水分的通透性变化等Willmer et al., 2005: schmidt-nielsen and SchmidtNielsen,2011)。 Sperber(1944)提出,哺乳动物的肾髓质长度与动物梄息环境中的干旱程度相关,栖息于干旱地区动物的相对髓质厚度( relativemedullar thickness,RMT)高于栖息于潮湿地区的动物。因此,RMT可用于评估动物调节体内水分的能力以及对干旱环境的适应程度。RMT与尿液浓缩能力呈正相关关系( Schmidt- Nilsen et al.1961),一般哺乳动物的最大尿液渗透压(U)在干旱环境要高于湿润环境( Heisinger and bre-itenbach, 1969: Brownfield and Wunder, 1976: Beuchat, 1996: Buffenstein et al., 1999: Laakkonen2002)。通过RMT指数可以预测野生动物浓缩尿液的能力( Greenwald,1989; Diaz and Ojeda,1999Al- Kahtani et al.,2004)。除RMT外,还有多种肾脏形态学参数,如髓质厚度与皮质厚度比me0 dullar thickness to cortical thickness,M/C)、髓质面积百分比( percent medullar area,PMA)和髓质厚度百分比( percent medullar thickness,PMT)等指标,可用于评估肾脏髓质的相对厚度和面积(Heisinger and Breitenbach, 1969: Schmid,1972Brownfield and wunder,1976)。此外,内髓质及肾
乳头也参与尿液浓缩过程( schmidt-nielsen andO'Dell,1961),内髓质是尿素循环累积的场所( Yang and Bankir,2005),更大面积的内髓质表示更强的尿素累积能力,通过测定内髓质面积与肾脏面积、髓质面积或皮质面积的比值(Tejo,2014)可以评估肾脏对水环境的适应能力。研究表明,生活于干旱地区的小型哺乳动物,其肾脏形态学的各种指标均较高( al-kahtani et al.,2004)。此外,肾脏的组织学结构,如肾小球的滤过面积、肾小球密度等也是测定动物尿液浓缩能力的重要指标(Sperber, 1944: Brownfield and Wunder, 1976; Zer-本研究中的5种啮齿动物,布氏田鼠( Lasiopodomys brandtii)、长爪沙鼠( Meriones unguiculatus)、黑线仓鼠( Cricetulus barabensis)、小毛足鼠( Phodopus roborovskii)和坎氏毛足鼠(Pho-dopus campbelli),都分布于内蒙古草原,栖息环境横跨典型草原、荒漠草原、荒漠和沙漠,水分的可利用性地理差异很大。布氏田鼠分布于植被较丰富的典型草原地区,为典型的日行性动物(宛新荣2006),随着光周期的缩短和温度的逐渐下降,其肾脏湿重显著升高,但肾脏干重无明显变化(张志强等,2007)。而饲喂高蛋白食物会使其繁殖期种群肾脏重量显著增加(娄美芳等,2013)。长爪沙鼠喜居于土壤疏松的沙地、农田和半荒漠的开垦区(夏武平等,1966),其肾脏大小与性别和季节无关(张志强和王德华,2009)。黑线仓鼠栖息地较广泛,喜欢栖居在沙质土地中且洞穴多分布于地势较高的干燥环境(张知彬和王祖望,1998)。小毛足鼠为内蒙古沙地生境中主要鼠种之一,在固定沙丘、半固定沙丘、流动沙丘上均有分布( Allen1940;赵肯堂,1981;黄文几等,1995),其洞口般在沙丘的中上部位,且大多位于阳坡(王广和等,2001)。坎氏毛足鼠主要栖息于干旱草原和半荒漠草原,分布在生长有蒿草( Artemisia argyi)、委陵菜( Potentilla chinensis)和锦鸡儿( CaraganaSILICON)的开放沙丘以及山地草原和人类聚居区喜干旱环境(Ross,1995;黄文几等,1995;罗泽珣尊,2000)。长爪沙鼠、黑线仓鼠、小毛足鼠和坎氏毛足鼠均为食谷类动物,其野外食物组成主要为植物种子,其中长爪沙鼠、坎氏毛足鼠和黑线仓鼠在春夏季也会采食植物的茎叶(夏武平等,1966黄文几等,1995;张知彬,1998;周延林等,2000;罗泽珣等,2000),长爪沙鼠在秋季还会贮存植物种子(刘伟等,2005)。布氏田鼠为草食性动物,主要食物为植物的茎叶等,春夏季节食性会随环境中植物可利用性变化而变化(王桂明等,1992;陈卫等,2000),冬季利用贮存的干草(宛新荣,2006)。通过比较5种动物的肾脏形态特征差异,可加深对动物适应环境机理的了解。我们预测,生活于典型草原地区的布氏田鼠,其肾脏RMT指数应较低,尿液浓缩能力较生活环境更为干旱且采食种子的其它4种动物低。长爪沙鼠生境中水分的可利用性较荒漠和沙漠高,其肾脏浓缩尿液能力高于布氏田鼠但低于其它3种栖息在荒漠或沙漠环境中的物种。黑线仓鼠、小毛足鼠和坎氏毛足鼠体型较小,具有较高的体表面积比,且沙地中水分可利用性较低,3种动物应具有较完善的尿液浓缩能力以保存水分。
1研究方法
1.1实验动物
长爪沙鼠(5雄,4雌)、布氏田鼠(4雄,5雌)、小毛足鼠(7雄,8雌)和坎氏毛足鼠(5雄,6雌)均来自室内繁殖种群,黑线仓鼠(5雄,5雌)为野外捕获,之后在室内饲养1个月所有实验动物均为成年个体。动物饲养房温度为23℃±1℃,光照为16h:8h。布氏田鼠饲喂标准兔饲料块,其余4种动物均饲喂标准鼠饲料。饲料均购自北京科澳协力饲料有限公司。动物自由取食和饮水。实验处理前,动物单笼(30cm×15cm20cm)饲养至少两周。
1.2尿液渗透压测定
使用电子天平(赛多利斯公司,精确至0.1g)称量动物体重。于动物活动相开始时间,连续3d,每日凌晨04:00收集日行性动物长爪沙鼠、布氏田鼠尿液,晚20:00收集夜行性动物小毛足鼠、坎氏毛足鼠和黑线仓鼠尿液。尿液收集方法参照 Kurien和 Scofield(1999)的方法。将动物置入捕鼠笼(25cm×10cm×10cm)中,笼下放置覆盖有塑料薄膜的白色纸板,待动物在自然状态下排出尿液后,以移液器移入离心管中。单次收集尿液量约为30-250μL。参照说明书,使用冰点渗透压仪(SMC30B,天河分析仪器,天津)测定尿液渗透压。每个样品重复测定3次( Xu and wang,2016)。计算单只动物3日尿液渗透压均值作为该动物平均尿液渗透压,去除3日尿液渗透压剧烈波动个体。
1.3肾脏形态学特征测定
动物经CO,过量处死,快速摘取两侧肾脏,去除肾周脂肪和结缔组织,以吸水纸吸去表面液体后称重(精确至0.001g)。左侧肾脏固定于4%多聚甲醛溶液中16h后,使用游标卡尺(精确至0.1mm)测量左肾脏长(L)、宽(W)、厚(T)。沿额状切面过肾乳头最长部将肾脏切分为两部分。将切面置于立体显微镜( OLYMPUS SZX16)(10×)下,可清晰辨别皮质与髓质的分界线及外髓质与内髓质的分界线,利用 dpz-bsw软件拍摄图像,并利用该软件内测量工具测量皮质厚度( corticalthickness,CT)、髓质厚度( medullar thicknessMT)、外髓质厚度( outer medullar thickness,OMT)、内髓质厚度( inner medullar thickness,IMT)、皮质面积( artical area,CA)、外髓质面积( outer medullar area,MA)和内髓质面积(in-ner medullar area,IMA)( Peluso,1978)。计算以下肾脏指数:相对髓质厚度(RMT)=髓质厚度10/(长+宽+厚)13( Sperber,1944);髓质与皮质tt (ratio of medullar thickness to cortical thicknessM/C)=髓质厚度/皮质厚度;内髓质面积与肾脏面EA tk (ratio of inner medullar area to renal areaIMA/RA)=内髓质面积/肾脏面积;内髓质面积与皮质面积比( ratio of inner medullar area to corticalarea,IMA/CA)=内髓质面积/皮质面积;内髓质面积与髓质面积比( ratio of inner medullar area tomedullar area,IMA/MA)=内髓质面积/髓质面积其中,RMT和M/C用以评估肾脏中髓质厚度的相对长度以及髓质厚度与皮质厚度的比例,从而用于比较不同动物髓质厚度特性差异;IMA/RA、IMA/MA和IMA/CA用以评估内髓质面积在肾脏中所占比例,从而用于比较不同动物内髓质面积特性差异(Tejo,2014)。
1.4肾脏组织学观察及其相关参数测定取动物右侧肾脏置于 Bouin氏液中固定24h后,经梯度酒精脱水、二甲苯透明后石蜡包埋。使用石蜡切片机连续切取6μm厚的切片40张,在每张阳离子黏附载玻片上水平放置8个连续切片,使各组织切片各向同质分布( Henery and Mayhew,1989)。贴片、烤片后37℃过夜。二甲苯脱蜡后,经梯度酒精复水,苏木精一伊红染色,中性树脂封片。将40张切片按1-40编号,选取4、8、1216、20、24、28、32、36、40号切片( Cavalieri原则),置于光学显微镜(40×)下得到10个视野,拍摄图片。利用 Image I软件统计10倍镜下各肾单位数目,计算肾单位密度(个/mm2)。计算公式为:肾单位密度=肾单位数目/视野面积5最大尿液渗透压预测值计算根据肾脏形态指数,依据 Brownfield和 Wunder(1976)提出的公式,对5种动物最大尿液渗透压进行预测。计算公式U(RMT×488)+204为取自体重、肾重和RMT相关关系的常数。
1.6数据统计分析
数据处理采用SPSS20.0软件包。统计分析前,所有数据经过正态分布( Kolmogorov- Smirnowtest)和方差齐性检验( Levene tests)。利用Pear-son相关分析( Pearson correlation analysis)检验体重与肾脏形态学、组织学参数和尿液渗透压之间的相关关系。若该指标与体重不相关,则采用单因素方差分析(One- way anova)比较该指标的种间差异。若该指标与体重相关,则以体重为协变量,采用单因素协方差分析(One- ay ancova)比较该指标的种间差异。以性别因素作为固定因子对肾脏形态学、组织学参数和尿液渗透压数据分别进行双因素方差分析与双因素协方差分析显示,性别对各指数无显著影响,故将雌雄数据合并分析。数据均以平均值±标准误(mean±SE)表示,P<0.05表示差异显著(双尾检验)2结果肾脏形态学参数的种间比较P相关分析表明,RMT(r=-0.03P=0.423)、M/C(r=0.191,P=0.443)和IMA/MA(r=0.240,P=0.081)与体重不相关。肾脏指数(r=-0.365,P=0.007)、IM/C(r=0.P=0.001)、IMA/RA(r=0.44,P=0.001)和IMA/CA(r=0.590,P<0.001)与体重相关5种动物肾脏指数和肾脏形态学指数均具有显著的种间差异。小毛足鼠、黑线仓鼠和坎氏毛足鼠体重之间无显著差异,坎氏毛足鼠的肾脏指数与长爪沙鼠和布氏田鼠接近,高于黑线仓鼠和小毛足鼠。RMT比较显示,小毛足鼠最大,黑线仓鼠次之,长爪沙鼠与布氏田鼠居中,坎氏毛足鼠最小;M/C指数则为黑线仓鼠和长爪沙鼠高于坎氏毛足鼠,但三者均与小毛足鼠和布氏田鼠无显著性差异。内髓质面积指数(IMA/RA、IMA/CA、IMA/MA)则显示,长爪沙鼠、布氏田鼠和黑线仓鼠具有相对面积更大的内髓质,小毛足鼠和坎氏毛足鼠内髓质相对面积小于黑线仓鼠。
2.2肾脏组织学参数的种间比较。
5种动物的皮质肾单位密度与体重不相关(r=0.073,P=0.349),近髓肾单位密度与体重呈正相关(r=0.350,P=0.027)皮质肾单位密度无显著的种间差异(F4,3=2.067,P=0.108);近髓肾单位密度黑线仓鼠与长爪沙鼠和布氏田鼠接近,但显著高于小毛足鼠和坎氏毛足鼠(F43=5.907,P=0.001)。
2.3尿液渗透压及最大尿液渗透压预测值的种间比较尿液渗透压与动物体重不相关(r=0.110P=0.402)。长爪沙鼠、小毛足鼠和坎氏毛足鼠的尿液渗透压彼此接近,但都显著高于布氏田鼠和黑线仓鼠(F4.5=21.722,P<0.001)。最大尿液渗透压预测值与体重也不相关(r=-0.62P=0.655)。小毛足鼠最大尿液渗透压预测值最高,显著高于布氏田鼠,坎氏毛足鼠最低。
3讨论
哺乳动物肾脏形态与其体重、食性和梄息地环境相适应( Beuchat,1990; Brooker and Withers,1994: Beuchat, 1996; Schondube et al., 2001)o沙漠地区生存的啮齿动物通常具有比生活于湿润地区动物高的RMT指数(表2)。Al- kahtani(2004)对啮齿动物相对髓质厚度和栖息地环境、体型相关关系的研究也表明,干旱地区啮齿动物的RMT值比生活于湿润地区动物高,具有更强的尿液浓缩能力。此外,内髓质作为髓质中重要的组成部分,其内分布的肾小管和直小血管的结构均对动物尿液浓缩能力具有影响( Beuchat,1990; schimidt-niels-en,1995)。作为尿素循环累积的场所( Yang andBank ir,2005),内髓质内尿素的循环累积形成了较高的渗透梯度,从而进一步对尿液进行浓缩。外髓质为尿液中离子和水分分离的主要部位,高蛋白和高盐分饮食的动物通常具有扩大的外髓质(Catotti et al.,2006)。动物的节水能力表现了其对栖息地环境中水分条件的适应性。对黄胸鼠( Rattus tanezumi)的研究表明,其分布受到降雨条件的限制,而节水能力较黄胸鼠强的大仓鼠( Tscherskia triton)则可以分布在更为干旱的环境中(蔡正纬和黄文几1982)。
本研究中5种动物均具有相对较厚的肾髓质。布氏田鼠主要分布在典型草原地区,其生境中食物较丰富。与长爪沙鼠、小毛足鼠、坎氏毛足鼠和黑线仓鼠4种食谷类动物不同,布氏田鼠主要采食植物茎叶(王桂明等,1992;陈卫等,2000)。由于与植物茎叶相比,种子含水量较低,仅为鲜重的3%( Nagy and gruchasz,1944;Mor-ton and macmillen1982),因此布氏田鼠经由食物摄入的预成水更多。布氏田鼠尿液渗透压显著低于长爪沙鼠、小毛足鼠和坎氏毛足鼠。其肾脏形态指数以及组织学数据均与长爪沙鼠相似,未表现显著差异,但其髓质厚度要显著小于生活于荒漠半荒漠地区的小毛足鼠和黑线仓鼠。长爪沙鼠常见于荒漠草原,分布范围比布氏田鼠广,本研究测定其RMT(10.25)大于野外种群观测值(9.74)( Xu and wang,2016), Munkacsi等(1977)观测值为7.51。长爪沙鼠为昼行性动物,更容易通过蒸发作用丢失水分,由西向东对不同地理分布的长爪沙鼠比较发现,其总蒸发失水随环境干旱程度升高而降低( Shi et al.,2015)。与布氏田鼠相比,长爪沙鼠从食物中得到的预成水分很少,环境中水分可利用性更低。厚的髓质有助于其保存水分以应对缺水环境。5种动物中,黑线仓鼠肾脏形态指数均较高,对肾脏中肾小球的密度测定结果显示,黑线仓鼠皮质肾单位密度较近髓肾单位大,且近髓肾单位密度为5种动物中最高。黑线仓鼠分布较广泛,北至黑龙江地区,南至长江以北的广大地区(陈卫等2000)。栖息地环境包括草原、半荒漠、农田、山坡及河谷。喜欢栖居于沙质土地中且洞穴多分布于地势较高的干燥环境(张知彬和王祖望,1998)其食物主要为植物种子(张知彬,1997)。由肾脏形态和组织学特点以及预测的最大尿液渗透压值(5518±455)mOsm/kg,黑线仓鼠应该具有较强的尿液浓缩能力,与其食用谷类的食性相适应,本研究捕获的黑线仓鼠来自乌日图塔拉,生存环境多沙地,高的尿液浓缩能力可以帮助其应对沙地环境中水分的缺乏。实验室内条件下,测定的尿液渗透压却较低,仅为(1178±248)mOsm/kg。我们推测由于实验用黑线仓鼠在室内饲养时间较短(37d)尚未适应实验室内环境。与野外环境相比,黑线仓鼠摄入预成水分较多,大量饮用水分可能导致其尿液渗透压偏低。小毛足鼠与坎氏毛足鼠也为食谷类啮齿动物且生活于沙化地区,主要在夜间进行活动,栖息地中水分环境更加严酷。小毛足鼠的食物组成中,种子可达到85%以上,其余部分为昆虫与植物茎叶(宛新荣,2007),且其分布范围较坎氏毛足鼠更广。小毛足鼠肾脏内髓质面积指数虽与坎氏毛足鼠相类似,具有较小的内髓质,其近髓肾单位密度也无显著性差异,但其RMT指数为5种动物中最高,有研究者观测到,在禁水条件下,小毛足鼠尿液渗透压达到4278 most/kg(Ross,1994b)。有研究报道坎氏毛足鼠在禁水条件下所产生尿液的渗透压可高达5550mOsm/kg(Ross,1995a),本研究测得其尿液渗透压也较高,但肾脏形态指数和组织学数据均未预示其具有较明显的高尿液浓缩能力,可能存在其它机制,如肾小管重吸收能力和尿素转运能力的强化使其可产生高渗透压尿液,这一推测尚需进一步实验验证。
4结论
内蒙古草原的5种啮齿动物肾脏髓质厚度表现了一定的地理差异性,与水分的可利用性相一致。相对较厚的髓质有助于动物更好地浓缩尿液从而减少水分的散失。在室内条件下,小毛足鼠、长爪沙鼠和坎氏毛足鼠较高的尿液渗透压可表明在未受到水分胁迫的情况下,这些物种仍保持较高的尿液浓缩能力,这是对干旱环境适应的表现。野外条件下,5种动物面临着不同的水分条件,肾脏形态和功能将发生相应的变化。
致谢:感谢中国科学院动物研究所动物生理生态学研究组全体成员在实验过程中给予的帮助以及在写作过程中提供的宝贵建议。感谢中科院动物研究所森林害虫化学生态研究组孟洁同学在立体显微镜使用方面提供的帮助。
陆生哺乳动物可通过肾脏重吸收原尿中水分来控制尿液的多少和渗透压,进而调节体液的浓度和体积,维持体内水分平衡(Al- kahtani et al.,2004: Willmer, 2005: schimidt-nilsen and SchimidtNilsen,2011)。当水分摄入量很低时,为减少随代谢废物流失的水分,动物会产生高渗透压尿液(Al- ahtani et al.,2004)。这种浓缩尿液的能力,依赖于肾脏中亨氏小管的构造及其组织学特性,以及细胞生物学作用,如管壁对水分的通透性变化等Willmer et al., 2005: schmidt-nielsen and SchmidtNielsen,2011)。 Sperber(1944)提出,哺乳动物的肾髓质长度与动物梄息环境中的干旱程度相关,栖息于干旱地区动物的相对髓质厚度( relativemedullar thickness,RMT)高于栖息于潮湿地区的动物。因此,RMT可用于评估动物调节体内水分的能力以及对干旱环境的适应程度。RMT与尿液浓缩能力呈正相关关系( Schmidt- Nilsen et al.1961),一般哺乳动物的最大尿液渗透压(U)在干旱环境要高于湿润环境( Heisinger and bre-itenbach, 1969: Brownfield and Wunder, 1976: Beuchat, 1996: Buffenstein et al., 1999: Laakkonen2002)。通过RMT指数可以预测野生动物浓缩尿液的能力( Greenwald,1989; Diaz and Ojeda,1999Al- Kahtani et al.,2004)。除RMT外,还有多种肾脏形态学参数,如髓质厚度与皮质厚度比me0 dullar thickness to cortical thickness,M/C)、髓质面积百分比( percent medullar area,PMA)和髓质厚度百分比( percent medullar thickness,PMT)等指标,可用于评估肾脏髓质的相对厚度和面积(Heisinger and Breitenbach, 1969: Schmid,1972Brownfield and wunder,1976)。此外,内髓质及肾
乳头也参与尿液浓缩过程( schmidt-nielsen andO'Dell,1961),内髓质是尿素循环累积的场所( Yang and Bankir,2005),更大面积的内髓质表示更强的尿素累积能力,通过测定内髓质面积与肾脏面积、髓质面积或皮质面积的比值(Tejo,2014)可以评估肾脏对水环境的适应能力。研究表明,生活于干旱地区的小型哺乳动物,其肾脏形态学的各种指标均较高( al-kahtani et al.,2004)。此外,肾脏的组织学结构,如肾小球的滤过面积、肾小球密度等也是测定动物尿液浓缩能力的重要指标(Sperber, 1944: Brownfield and Wunder, 1976; Zer-本研究中的5种啮齿动物,布氏田鼠( Lasiopodomys brandtii)、长爪沙鼠( Meriones unguiculatus)、黑线仓鼠( Cricetulus barabensis)、小毛足鼠( Phodopus roborovskii)和坎氏毛足鼠(Pho-dopus campbelli),都分布于内蒙古草原,栖息环境横跨典型草原、荒漠草原、荒漠和沙漠,水分的可利用性地理差异很大。布氏田鼠分布于植被较丰富的典型草原地区,为典型的日行性动物(宛新荣2006),随着光周期的缩短和温度的逐渐下降,其肾脏湿重显著升高,但肾脏干重无明显变化(张志强等,2007)。而饲喂高蛋白食物会使其繁殖期种群肾脏重量显著增加(娄美芳等,2013)。长爪沙鼠喜居于土壤疏松的沙地、农田和半荒漠的开垦区(夏武平等,1966),其肾脏大小与性别和季节无关(张志强和王德华,2009)。黑线仓鼠栖息地较广泛,喜欢栖居在沙质土地中且洞穴多分布于地势较高的干燥环境(张知彬和王祖望,1998)。小毛足鼠为内蒙古沙地生境中主要鼠种之一,在固定沙丘、半固定沙丘、流动沙丘上均有分布( Allen1940;赵肯堂,1981;黄文几等,1995),其洞口般在沙丘的中上部位,且大多位于阳坡(王广和等,2001)。坎氏毛足鼠主要栖息于干旱草原和半荒漠草原,分布在生长有蒿草( Artemisia argyi)、委陵菜( Potentilla chinensis)和锦鸡儿( CaraganaSILICON)的开放沙丘以及山地草原和人类聚居区喜干旱环境(Ross,1995;黄文几等,1995;罗泽珣尊,2000)。长爪沙鼠、黑线仓鼠、小毛足鼠和坎氏毛足鼠均为食谷类动物,其野外食物组成主要为植物种子,其中长爪沙鼠、坎氏毛足鼠和黑线仓鼠在春夏季也会采食植物的茎叶(夏武平等,1966黄文几等,1995;张知彬,1998;周延林等,2000;罗泽珣等,2000),长爪沙鼠在秋季还会贮存植物种子(刘伟等,2005)。布氏田鼠为草食性动物,主要食物为植物的茎叶等,春夏季节食性会随环境中植物可利用性变化而变化(王桂明等,1992;陈卫等,2000),冬季利用贮存的干草(宛新荣,2006)。通过比较5种动物的肾脏形态特征差异,可加深对动物适应环境机理的了解。我们预测,生活于典型草原地区的布氏田鼠,其肾脏RMT指数应较低,尿液浓缩能力较生活环境更为干旱且采食种子的其它4种动物低。长爪沙鼠生境中水分的可利用性较荒漠和沙漠高,其肾脏浓缩尿液能力高于布氏田鼠但低于其它3种栖息在荒漠或沙漠环境中的物种。黑线仓鼠、小毛足鼠和坎氏毛足鼠体型较小,具有较高的体表面积比,且沙地中水分可利用性较低,3种动物应具有较完善的尿液浓缩能力以保存水分。
1研究方法
1.1实验动物
长爪沙鼠(5雄,4雌)、布氏田鼠(4雄,5雌)、小毛足鼠(7雄,8雌)和坎氏毛足鼠(5雄,6雌)均来自室内繁殖种群,黑线仓鼠(5雄,5雌)为野外捕获,之后在室内饲养1个月所有实验动物均为成年个体。动物饲养房温度为23℃±1℃,光照为16h:8h。布氏田鼠饲喂标准兔饲料块,其余4种动物均饲喂标准鼠饲料。饲料均购自北京科澳协力饲料有限公司。动物自由取食和饮水。实验处理前,动物单笼(30cm×15cm20cm)饲养至少两周。
1.2尿液渗透压测定
使用电子天平(赛多利斯公司,精确至0.1g)称量动物体重。于动物活动相开始时间,连续3d,每日凌晨04:00收集日行性动物长爪沙鼠、布氏田鼠尿液,晚20:00收集夜行性动物小毛足鼠、坎氏毛足鼠和黑线仓鼠尿液。尿液收集方法参照 Kurien和 Scofield(1999)的方法。将动物置入捕鼠笼(25cm×10cm×10cm)中,笼下放置覆盖有塑料薄膜的白色纸板,待动物在自然状态下排出尿液后,以移液器移入离心管中。单次收集尿液量约为30-250μL。参照说明书,使用冰点渗透压仪(SMC30B,天河分析仪器,天津)测定尿液渗透压。每个样品重复测定3次( Xu and wang,2016)。计算单只动物3日尿液渗透压均值作为该动物平均尿液渗透压,去除3日尿液渗透压剧烈波动个体。
1.3肾脏形态学特征测定
动物经CO,过量处死,快速摘取两侧肾脏,去除肾周脂肪和结缔组织,以吸水纸吸去表面液体后称重(精确至0.001g)。左侧肾脏固定于4%多聚甲醛溶液中16h后,使用游标卡尺(精确至0.1mm)测量左肾脏长(L)、宽(W)、厚(T)。沿额状切面过肾乳头最长部将肾脏切分为两部分。将切面置于立体显微镜( OLYMPUS SZX16)(10×)下,可清晰辨别皮质与髓质的分界线及外髓质与内髓质的分界线,利用 dpz-bsw软件拍摄图像,并利用该软件内测量工具测量皮质厚度( corticalthickness,CT)、髓质厚度( medullar thicknessMT)、外髓质厚度( outer medullar thickness,OMT)、内髓质厚度( inner medullar thickness,IMT)、皮质面积( artical area,CA)、外髓质面积( outer medullar area,MA)和内髓质面积(in-ner medullar area,IMA)( Peluso,1978)。计算以下肾脏指数:相对髓质厚度(RMT)=髓质厚度10/(长+宽+厚)13( Sperber,1944);髓质与皮质tt (ratio of medullar thickness to cortical thicknessM/C)=髓质厚度/皮质厚度;内髓质面积与肾脏面EA tk (ratio of inner medullar area to renal areaIMA/RA)=内髓质面积/肾脏面积;内髓质面积与皮质面积比( ratio of inner medullar area to corticalarea,IMA/CA)=内髓质面积/皮质面积;内髓质面积与髓质面积比( ratio of inner medullar area tomedullar area,IMA/MA)=内髓质面积/髓质面积其中,RMT和M/C用以评估肾脏中髓质厚度的相对长度以及髓质厚度与皮质厚度的比例,从而用于比较不同动物髓质厚度特性差异;IMA/RA、IMA/MA和IMA/CA用以评估内髓质面积在肾脏中所占比例,从而用于比较不同动物内髓质面积特性差异(Tejo,2014)。
1.4肾脏组织学观察及其相关参数测定取动物右侧肾脏置于 Bouin氏液中固定24h后,经梯度酒精脱水、二甲苯透明后石蜡包埋。使用石蜡切片机连续切取6μm厚的切片40张,在每张阳离子黏附载玻片上水平放置8个连续切片,使各组织切片各向同质分布( Henery and Mayhew,1989)。贴片、烤片后37℃过夜。二甲苯脱蜡后,经梯度酒精复水,苏木精一伊红染色,中性树脂封片。将40张切片按1-40编号,选取4、8、1216、20、24、28、32、36、40号切片( Cavalieri原则),置于光学显微镜(40×)下得到10个视野,拍摄图片。利用 Image I软件统计10倍镜下各肾单位数目,计算肾单位密度(个/mm2)。计算公式为:肾单位密度=肾单位数目/视野面积5最大尿液渗透压预测值计算根据肾脏形态指数,依据 Brownfield和 Wunder(1976)提出的公式,对5种动物最大尿液渗透压进行预测。计算公式U(RMT×488)+204为取自体重、肾重和RMT相关关系的常数。
1.6数据统计分析
数据处理采用SPSS20.0软件包。统计分析前,所有数据经过正态分布( Kolmogorov- Smirnowtest)和方差齐性检验( Levene tests)。利用Pear-son相关分析( Pearson correlation analysis)检验体重与肾脏形态学、组织学参数和尿液渗透压之间的相关关系。若该指标与体重不相关,则采用单因素方差分析(One- way anova)比较该指标的种间差异。若该指标与体重相关,则以体重为协变量,采用单因素协方差分析(One- ay ancova)比较该指标的种间差异。以性别因素作为固定因子对肾脏形态学、组织学参数和尿液渗透压数据分别进行双因素方差分析与双因素协方差分析显示,性别对各指数无显著影响,故将雌雄数据合并分析。数据均以平均值±标准误(mean±SE)表示,P<0.05表示差异显著(双尾检验)2结果肾脏形态学参数的种间比较P相关分析表明,RMT(r=-0.03P=0.423)、M/C(r=0.191,P=0.443)和IMA/MA(r=0.240,P=0.081)与体重不相关。肾脏指数(r=-0.365,P=0.007)、IM/C(r=0.P=0.001)、IMA/RA(r=0.44,P=0.001)和IMA/CA(r=0.590,P<0.001)与体重相关5种动物肾脏指数和肾脏形态学指数均具有显著的种间差异。小毛足鼠、黑线仓鼠和坎氏毛足鼠体重之间无显著差异,坎氏毛足鼠的肾脏指数与长爪沙鼠和布氏田鼠接近,高于黑线仓鼠和小毛足鼠。RMT比较显示,小毛足鼠最大,黑线仓鼠次之,长爪沙鼠与布氏田鼠居中,坎氏毛足鼠最小;M/C指数则为黑线仓鼠和长爪沙鼠高于坎氏毛足鼠,但三者均与小毛足鼠和布氏田鼠无显著性差异。内髓质面积指数(IMA/RA、IMA/CA、IMA/MA)则显示,长爪沙鼠、布氏田鼠和黑线仓鼠具有相对面积更大的内髓质,小毛足鼠和坎氏毛足鼠内髓质相对面积小于黑线仓鼠。
2.2肾脏组织学参数的种间比较。
5种动物的皮质肾单位密度与体重不相关(r=0.073,P=0.349),近髓肾单位密度与体重呈正相关(r=0.350,P=0.027)皮质肾单位密度无显著的种间差异(F4,3=2.067,P=0.108);近髓肾单位密度黑线仓鼠与长爪沙鼠和布氏田鼠接近,但显著高于小毛足鼠和坎氏毛足鼠(F43=5.907,P=0.001)。
2.3尿液渗透压及最大尿液渗透压预测值的种间比较尿液渗透压与动物体重不相关(r=0.110P=0.402)。长爪沙鼠、小毛足鼠和坎氏毛足鼠的尿液渗透压彼此接近,但都显著高于布氏田鼠和黑线仓鼠(F4.5=21.722,P<0.001)。最大尿液渗透压预测值与体重也不相关(r=-0.62P=0.655)。小毛足鼠最大尿液渗透压预测值最高,显著高于布氏田鼠,坎氏毛足鼠最低。
3讨论
哺乳动物肾脏形态与其体重、食性和梄息地环境相适应( Beuchat,1990; Brooker and Withers,1994: Beuchat, 1996; Schondube et al., 2001)o沙漠地区生存的啮齿动物通常具有比生活于湿润地区动物高的RMT指数(表2)。Al- kahtani(2004)对啮齿动物相对髓质厚度和栖息地环境、体型相关关系的研究也表明,干旱地区啮齿动物的RMT值比生活于湿润地区动物高,具有更强的尿液浓缩能力。此外,内髓质作为髓质中重要的组成部分,其内分布的肾小管和直小血管的结构均对动物尿液浓缩能力具有影响( Beuchat,1990; schimidt-niels-en,1995)。作为尿素循环累积的场所( Yang andBank ir,2005),内髓质内尿素的循环累积形成了较高的渗透梯度,从而进一步对尿液进行浓缩。外髓质为尿液中离子和水分分离的主要部位,高蛋白和高盐分饮食的动物通常具有扩大的外髓质(Catotti et al.,2006)。动物的节水能力表现了其对栖息地环境中水分条件的适应性。对黄胸鼠( Rattus tanezumi)的研究表明,其分布受到降雨条件的限制,而节水能力较黄胸鼠强的大仓鼠( Tscherskia triton)则可以分布在更为干旱的环境中(蔡正纬和黄文几1982)。
本研究中5种动物均具有相对较厚的肾髓质。布氏田鼠主要分布在典型草原地区,其生境中食物较丰富。与长爪沙鼠、小毛足鼠、坎氏毛足鼠和黑线仓鼠4种食谷类动物不同,布氏田鼠主要采食植物茎叶(王桂明等,1992;陈卫等,2000)。由于与植物茎叶相比,种子含水量较低,仅为鲜重的3%( Nagy and gruchasz,1944;Mor-ton and macmillen1982),因此布氏田鼠经由食物摄入的预成水更多。布氏田鼠尿液渗透压显著低于长爪沙鼠、小毛足鼠和坎氏毛足鼠。其肾脏形态指数以及组织学数据均与长爪沙鼠相似,未表现显著差异,但其髓质厚度要显著小于生活于荒漠半荒漠地区的小毛足鼠和黑线仓鼠。长爪沙鼠常见于荒漠草原,分布范围比布氏田鼠广,本研究测定其RMT(10.25)大于野外种群观测值(9.74)( Xu and wang,2016), Munkacsi等(1977)观测值为7.51。长爪沙鼠为昼行性动物,更容易通过蒸发作用丢失水分,由西向东对不同地理分布的长爪沙鼠比较发现,其总蒸发失水随环境干旱程度升高而降低( Shi et al.,2015)。与布氏田鼠相比,长爪沙鼠从食物中得到的预成水分很少,环境中水分可利用性更低。厚的髓质有助于其保存水分以应对缺水环境。5种动物中,黑线仓鼠肾脏形态指数均较高,对肾脏中肾小球的密度测定结果显示,黑线仓鼠皮质肾单位密度较近髓肾单位大,且近髓肾单位密度为5种动物中最高。黑线仓鼠分布较广泛,北至黑龙江地区,南至长江以北的广大地区(陈卫等2000)。栖息地环境包括草原、半荒漠、农田、山坡及河谷。喜欢栖居于沙质土地中且洞穴多分布于地势较高的干燥环境(张知彬和王祖望,1998)其食物主要为植物种子(张知彬,1997)。由肾脏形态和组织学特点以及预测的最大尿液渗透压值(5518±455)mOsm/kg,黑线仓鼠应该具有较强的尿液浓缩能力,与其食用谷类的食性相适应,本研究捕获的黑线仓鼠来自乌日图塔拉,生存环境多沙地,高的尿液浓缩能力可以帮助其应对沙地环境中水分的缺乏。实验室内条件下,测定的尿液渗透压却较低,仅为(1178±248)mOsm/kg。我们推测由于实验用黑线仓鼠在室内饲养时间较短(37d)尚未适应实验室内环境。与野外环境相比,黑线仓鼠摄入预成水分较多,大量饮用水分可能导致其尿液渗透压偏低。小毛足鼠与坎氏毛足鼠也为食谷类啮齿动物且生活于沙化地区,主要在夜间进行活动,栖息地中水分环境更加严酷。小毛足鼠的食物组成中,种子可达到85%以上,其余部分为昆虫与植物茎叶(宛新荣,2007),且其分布范围较坎氏毛足鼠更广。小毛足鼠肾脏内髓质面积指数虽与坎氏毛足鼠相类似,具有较小的内髓质,其近髓肾单位密度也无显著性差异,但其RMT指数为5种动物中最高,有研究者观测到,在禁水条件下,小毛足鼠尿液渗透压达到4278 most/kg(Ross,1994b)。有研究报道坎氏毛足鼠在禁水条件下所产生尿液的渗透压可高达5550mOsm/kg(Ross,1995a),本研究测得其尿液渗透压也较高,但肾脏形态指数和组织学数据均未预示其具有较明显的高尿液浓缩能力,可能存在其它机制,如肾小管重吸收能力和尿素转运能力的强化使其可产生高渗透压尿液,这一推测尚需进一步实验验证。
4结论
内蒙古草原的5种啮齿动物肾脏髓质厚度表现了一定的地理差异性,与水分的可利用性相一致。相对较厚的髓质有助于动物更好地浓缩尿液从而减少水分的散失。在室内条件下,小毛足鼠、长爪沙鼠和坎氏毛足鼠较高的尿液渗透压可表明在未受到水分胁迫的情况下,这些物种仍保持较高的尿液浓缩能力,这是对干旱环境适应的表现。野外条件下,5种动物面临着不同的水分条件,肾脏形态和功能将发生相应的变化。
致谢:感谢中国科学院动物研究所动物生理生态学研究组全体成员在实验过程中给予的帮助以及在写作过程中提供的宝贵建议。感谢中科院动物研究所森林害虫化学生态研究组孟洁同学在立体显微镜使用方面提供的帮助。
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