进口啮齿类动物手术器械好吗
来源：未知 |发布时间：2021-05-12 15:16|点击:次
实时荧光定量RT-PCR方法在登革热小鼠模型中的评估及应用
目前国内尚未建立理想的重症登革热动物模型,缺乏指导性强、可靠稳定的病原学指标。文献报告指出病毒的定量检测可针对病毒颗粒、病毒抗原、病毒核酸等。传统方法有病毒分离方法,常用细胞培养分离和乳鼠颅内接种分离等,该方法比较可靠,但操作繁琐,实验周期长,不利于登革病毒的快速诊断。其次是抗原检测方法,酶联免疫吸附法(ELISA)胶体金免疫层析法(GICA)和免疫荧光法(IFA)等。但抗原检测方法操作繁琐,检测灵敏度较低,易与其他黄病毒发生交叉反应，产生假阳性。在过去的几十年,分子诊断技术不断进步,使得检测和鉴定各种病原体更加可靠。其中实时荧光定量PCR方法逐渐成为病毒快速诊断的新的金标准。本研究对现有登革病毒RT-PCR检测方法进行优化,创建一步法实时荧光定量RT-PCR方法,并用于登革病毒感染小鼠模型的评估。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物2日龄SPF级BALB/c雄性乳鼠20只,体重2~3g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0008],用于登革病毒的扩增。啮齿类动物手术器械。
4~6周清洁级C57BL/6背景的I型干扰素受体敲除小鼠(Ifnar1-1-)[SCXK(京)2014-0011],雌雄各半，共计40只,体重18~22g,由中国医学科学院医学实验动物研究所北方中心提供,用于登革热小鼠模型制备。动物实验方案得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用和管里委员会的批准(WW18002)。动物饲养与实验均在中国医学科学院医学实验动物研究所生物安全二级动物实验室(ABSL-2),遵照3R原则进行。啮齿类动物手术器械。
1.1.2病毒株
登革病毒(DENV):I型(TH-Sman株)、II型(NewGuinea株/NGC适应株(TH-36株)、II型(TH87株)、IV型(H241株)均购自ATCC,本课题组保存。特异性分析所用病毒株包括:肠道病毒71型EV71(MP10株)、柯萨奇病毒10型CA10(SJZK12-0046T株)、柯萨奇病毒16型CA16(Shzh05-万株数鼠肺炎病毒PVM(15株)、鼠肝炎.病毒MHV(A59株)、呼肠孤病毒REO(Abney株)、鼠诺如病毒MNV(CW1株)、及狂犬病毒RV(CVS株)分别由中国医学科学院医学实验动物研究所肠道病毒课题组、检测中心及本课题组提供。啮齿类动物手术器械。
1.2主要试剂与仪器
RNA提取试剂盒(RNeasyMiniKit:52904)和实时荧光定量PCR试剂盒(ProbeRT-PCRKit:204443);AppliedBiosystems7500实时荧光定量PCR仪。
1.3实验方法
1.3.1引物和探针
根据文献[4],选择特异引物和TaqMan探针,上下游引物及探针序列分别为:5'-GARAGACCAGAGATCCTGCTGTCT-3’;5’-ACCATTCCATTTTCTGGCGTT-3’;5'-FAM-AGCATCATTCCAGGCAC-MGB-3'。啮齿类动物手术器械。
1.3.2标准品的制备
选择II型登革病毒(NewGuinea株)3’UTR的目的片段制备标准品。使用上述特异性引物进行PCR扩增,将目的基因克隆于TOPO载体,构建质粒作为标准品,以上操作委托中美泰和公司完成。质粒合成后，用紫外分光光度计测定原倍标准品,质粒浓度为1035ng/μL。
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