长期和/或大量饮酒可引起酒精性肝损伤即酒精性肝病( alcoholic liver disease,ALD),虽然ALD的发生与酒精消耗的剂量和饮酒时间有关,且其进展有显著的特点,但目前还没有一个标准化的ALD动物模型,即缺乏与人类ALD完全类似的动物模型。而良好的实验动物模型对于探讨ALD的发病机制、筛选保肝药物以及预防和治疗方面等均有其重要意义,所以发展一个有效准确的AL动物模型势在必行。目前国内外已建立了多种ALD的动物模型,本文将重点回顾利用啮齿类动物(大鼠、小鼠)经口腔或胃内酒精暴露的急性和慢性模型,以便为今后建立更有效的动物模型提供参考。

　　1急性ALD动物模型

　　ALD最简单的模型可通过急性给药仅需几小时或者几天的时间就可形成。目前,建立急性ALD的动物模型以大鼠、小鼠较常用。复制急性ALD的模型,最常采用乙醇灌胃的方法,相比较其他途径更符合人的饮酒途径。

　　1.1国内急性ALD模型的研究情况国内多应用白酒灌胃及酒精腹腔注射的方法制作急性ALD动物模型,但造模时间、酒精的用量以及酒精的浓度报道不一。而在白酒灌胃的方法中又包括两类:一类是研究人员自行摸索适合自己试验的造模条件,如文献中常见的一些大鼠急性造模的剂量和时间4~8g/kg,1次/d,连续5~8d:7~20mL/kg,1次/d,连续5-10d所用乙醇的灌胃浓度为50~60%(v/)121。另类主要基于率先采用两种途径进行造模的赵静波等的研究方法。采用健康成熟雄性 Wistar或SD大鼠,一是用白酒灌胃,每次7mL/kg、2次/:对照组灌注等量生理盐水。另是腹腔内注射18%(w/)的乙醇溶液,每次20mL/kg、2次/d:对照组腹腔内注射等量生理盐水,实验周期最长10d且实验动物自由饮水和普通饲料喂养。结果10d后成功复制大鼠急性ALD模型,表现为肝细胞脂肪变性,伴轻度气球样变和炎性细胞浸润,并发现灌胃法造模优于腹腔注射法死亡率低,且相对符合人类饮酒习惯。

　　小鼠急性造模目前也没有统一的急性ALD造模方法应用高度白酒灌胃动物为国内最常用的方法,在喂养固体饲料的同时每天定时定量灌注一定浓度的白酒,既针对小鼠的厌酒天性,又避免了复杂的操作。国内报道过许多小鼠急性ALD模型的造模方法,较集中的方法有:谢议凤等每日给予小鼠35°二锅头白酒16mL/kg,连续10d,造成了小鼠急性肝损伤模型;赵敏等采用经口1次给予小鼠50%(v/v)乙醇,灌胃量为12mL/kgBW(折合乙醇的剂量为4.8g/kg

　　BW),禁食12h,1次即可出现ALD的早期表现。

　　1.2国外急性ALD模型研究现状近十年来国外对急性ALD模型的研究以小鼠居多。与国内研究相似的是 Carson等的研究为后续造模奠定了基础。方法为通过对B6C3F1雌性小鼠利用单剂量乙醇灌胃,观察暴饮模型的发展和表征包括血液酒精含量、酒后行为评估、肝脏损伤程度等。用生理盐水稀释的32%(v/v)的乙醇,实验各组分别给予3-7g/kg上述浓度乙醇,对照组给予与实验组中所用酒精体积最大一组等量的水进行灌胃,对各项指标进行了不同时间点的观察。其中对于肝脏损伤以谷丙转氨酶、碱性磷酸酶等为指标,观察其灌胃后4h、12h、24h、72h各项指标值的变化,结果发现仅有7g/kg组出现了轻度的肝损伤。同时本研

　　究还发现血液酒精清除时间在2~12h,其中8h后除7g/kg组外其佘各实验组血液中酒精都被清除。基于此项研究基础,许多模型制作进行了改动,如选取4.5g/kg、5g/kg或6g/kgBW的乙醇用量,每隔12h灌胃1次,总共3次或将乙醇浓度变化为25%~50%。另外一些研究是对大鼠进行造模,在评价栀子大黄汤对急性ALD的保护作用研究中,急性造模使用的是50%酒精以12mL/kgBW进行灌胃,持续8d,与空白对照组比较转氨酶升高(P<0.05);而在库普弗细胞源性前列腺素E2参与酒精引起的肝脏脂肪堆积时,用5g/kgBW乙醇给大鼠进行灌胃,其肝组织发生变化且肝脏甘油三酯升高(P<0.05)9。

　　2慢性ALD动物模型

　　肝脏是酒精代谢的主要场所,国内外已有许多学者进行慢性酒精中毒所致的ALD的病程和病理变化的研究,并创建了 Lieber- De carli模型、在饮水中加入酒精的模型、 Tsukamata- French模型及国内常用的酒精灌胃模型等

　　2.1自由饮用喂养模型在水中加入乙醇进行自由饮用的喂养优点是技术水平要求不高,一般只需要每日更换含有乙醇的液体即可。最初的乙醇暴露动物模型试图模仿人类饮酒方式,即自由饮用含乙醇的液体。虽然这一模式十分简单,但难以评估和控制与饮酒有关的营养因素在ALD发生中的作用。特别是啮齿类动物强烈厌恶乙醇的味道或气味,不易控制酒精的摄入量,而且大鼠肝脏对酒精代谢能力较强,容易对酒精形成耐受,故难以保持血中较高的酒精浓度。1949年Best等在乙醇饮用水模型中观察到并没有证据表明对肝细胞的毒性作用是纯酒精还是糖的原因。基于对这些观察,当时有人提出,ALD是由于伴随营养不足而不是酒精本身。195年 Keegan等应用单一酒精饮液加低脂饲料进行ALD模型的研究,方法:对 Wistar大鼠在最初3d以2%蔗糖溶液,自由饮用;然后在2%蔗糖溶液中加入浓度为5%的酒精,以后每隔4d提高酒精浓度5%。至15%后改为每周增加5%的酒精浓度直至40%,此时酒精占每日总热量的39%。造模大鼠以低脂肪、高蛋白,并含一定的胆碱、视黄醇、铁和糖类(占总热量的41%)的饲料喂养,持续喂养25周以上,结果:在造模16周时出现肝腺泡Ⅲ区轻度脂肪变:25周时可产生肝细胞脂肪变性、炎性细胞浸润及中央静脉周围纤维化等损害。该模型是通过食用固体食物和以乙醇溶液为饮料,并且饮食组成比例与人类接近。因此,它可能是一种切实可行的且与人类ALD相接近的动物模型,虽然在Best等研究的基础上有了改进,但仍有其缺陷,即不易控制酒精的摄入量,未能保证血中有效的酒精浓度,因此造模时间较长且模型肝脏病理改变轻微为了克服乙醇厌恶,自由饮用乙醇的替代技术被开发其中乙醇成为流质饮食,作为唯一的热量来源。研究这些流质饮食模式最多的是 Lieber和 De Carli,1963年首次发明了通过液体食料给大鼠喂饲酒精的方法。在这种模型中,大鼠被给予含有乙醇的流质饮食,通常弥补了36%的总热量摄入。1984年 Keegan等对饲料配方进行了改进。大鼠除了喂饲含酒精的液体饲料外,不再给其他任何食物或液体,酒精的摄入量达每日12-18g/kg。该饲料的热量构成比为蛋白质18%、脂肪35%、糖类47%(36%的热量由酒精替代),并含有维生素和无机盐。造模的 Wistar大鼠于实验的第4周出现明显的肝细胞脂肪变性,但未出现坏死与纤维化。进一步研究发现酒精性脂肪肝的严重程度与液体食料

　　中脂肪的含量有关12。在此方案下,啮齿动物天生对酒精的厌恶部分被克服,从而血液中酒精含量较仅在饮用水中添加乙醇的观察水平高。事实上,大鼠通过自由饮食每日摄入的

　　酒精量足以产生肝损伤指示了人类早期ALD,尤其是脂肪堆积。虽然 Lieber- DeCal模型是一种简便易行、费用低、形成率高及稳定性好的酒精性脂肪肝模型,但仍然有其局限性,即肝组织病理学变化有限,更严重的肝脏损伤是不能在该模型上观察到

　　2.2胃内喂养模型为了避开大小鼠对酒精的厌恶,通过手术植入胃管可使乙醇直接进入胃内。 Tsukamoto和 French等研究出一种肠内喂养乙醇的ALD模型,与 Lieber-DeCari方法相似,都是将乙醇作为流质饮食,但它是以一个恒定的注入速率让液体饮食进入代替了自由进食。方法:给SD大鼠手术植入胃管,持续注入含酒精的液体食料,由于不经口摄入酒精,酒精可调整至占总热量的47%。该模型最主要的优点是在短短的4周肠内饮食就可模仿出人类早期的AID病理变化的模型,此外,利用该模型在持续注入高脂酒精饲料的同时加入碳酰铁或者延长肠内喂养时间都可出现纤维化和肝硬化,另一个优点就是可以完全控制酒精和各种营养物质的摄人量,从而可以保证血中一定的酒精浓度,并且可研究酒精与营养因素之间的相互作用。改良后的这种模型也可用转基因小鼠进行实验性AD的研究。虽然Tsukamata- French模型是一种很好的酒精性肝病的模型,但酒精是强制注入的,不符合正常摄入过程,并且制作此模型需要一些技术上的特別训练,且所需的特殊设备价格昂贵等,目前仅在国外研究中被成功复制。

　　2.3酒精灌胃模型随着我国中药抗酒精性肝损伤及解酒药的深入研究,众多的动物模型被建立,包括大、小鼠ALD模型的建立和病理学观察以及一些动态性研究,其中以大鼠为研究对象的居多。吴光健等在建立慢性ALD大鼠模型中,在标准饲料喂养大鼠的基础上,模型组采用50%酒精,15mL/kg灌胃、2次/d,同时给予10%酒精饮料饲养,连续14周;对照组大鼠以相同的方式灌服同体积蒸馏水,饮用自来水,并应用光镜和电镜观察酒精对大鼠肝组织及超微结构的影响,结果模型组所有大鼠均出现了脂肪肝,91.6%的动物发生了酒精性肝炎,16.7%大鼠可见肝脏间质反应性增生。此外,唐媛婷等通过每天给予大鼠体积分数56%的白酒,8mL/kg灌胃,每周递增2mL/kg直至总剂量达16mL,/(kg·d),连续7周,结果显示:模型组肝细胞脂肪严重变性,面积在30%~75%之间,说明长期灌注大量乙醇可引起大鼠肝脏明显脂肪变。在此需特别提岀我国《保健食品检验与评价技术规范》中对酒精性肝损伤模型制作规范,用分析纯无水乙醇以蒸馏水稀释浓度至50%,对大、小鼠每日以1214mL/kgBW(折合乙醇的剂量6-7g/kgBW)进行灌胃持续30d,必要时可延长至45d。此外,国外有研究人员给雌性 Wistar大鼠胃内注入乙醇5g/(kg·d、1次ld,研究结果显示可产生与 Isukamata- French大鼠模型相似的肝组织学改变。

　　由于目前国内外尚未建立统一、完善的酒精性肝损伤动物模型。因此,急需建立一个与人类酒精性肝损伤病变发展过程相似的动物模型以研究酒精性肝损伤的机制,并探索其防治措施。