小白鼠解剖器械临床应用方法
来源：未知 |发布时间：2021-05-11 15:29|点击:次
采用离心冻干法冻干凝胶，并用0.05 mg／mL胰蛋白酶过夜消化，以2％三氟乙酸停止反应。采用二维液相串联质谱分析仪对多肽进行分析。小白鼠解剖器械，在第一维度使用溶剂A(200 mmol甲酸铵，pH值10.0)和溶剂B(CH3CN)，采用Masslynx 4.1自动设置的3个溶剂塞，依次洗脱馏分。在第二个维度，使用nanoACQUITY系统进行肽筛选。程序和数据步骤与先前研究相似。对于得到的数据使用自归一化函数进行归一化，使用NCBI数据库(2012年3月发布)作为参考数据库，仅保留高置信度蛋白(OK=2)作进一步分析。采用PLGS 2．4进行统计分析，差异表达蛋I刍(differentially expressedproteins，DEPs)定义为：P<0．05且Fold Change>1.5。
1.2.4 MMCs培养及siRNA转染MMCs置于含5％胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃，5％C02恒温细胞孵育箱中培养。稳定培养MMCs，待细胞汇合度超过70％时，使用0．25％胰酶消化，常温1 300 r／min离心5 min，小白鼠解剖器械，弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞，细胞计数；以每孔4 X105细胞数接种入6孔板中；将6 gL siRNA(si．VIL 1或NC)力H入250 gL Oppti—medium(每孔)，充分混匀后室温静置5 min，再加入6 gL RNAi Max(每孔)，振荡混匀，室温静置15 min后将含siRNA的转染混合液垂直缓慢滴入六孔板中，37℃孵育24 h后，更换新鲜培养液，再培养48 h收集细胞，待后续检测。
1.2.5 Hoechst染色检测细胞凋亡 将洁净盖玻片置于体积分数70％乙醇溶液中浸泡10 min，取出后放于无菌超净台内吹干，用细胞培养液洗涤3次后，将盖玻片置于6孔板内，接种MMCs后培养并按照小白鼠解剖器械，1.2.4中的步骤转染siRNA。转染48 h后，吸尽培养液，加入0．5 mL固定液固定10 min。吸取固定液后每孔加入2 mL PBS，置于摇床上漂洗3 min，共漂洗2次。吸尽PBS后，加入10 gglmL Hoechst 33342试剂，于37℃避光孵育10 min。孵育结束后，用PBS洗2次，每次3 min。加一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片。在200倍荧光显微镜下，每孔随机选取5个视野，观察细胞核浓缩细胞。通过计算细胞核浓缩细胞占细胞总数的百分比，明确细胞凋亡的程度。
1.2.66 5乙炔基脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色检测细胞增殖使用ClickiTEdU Alexa Fluor成像试剂盒对转染48 h的MMCs进行EdU检测，小白鼠解剖器械所有步骤严格遵循说明书进行。染色后，EdU阳性细胞的细胞核为红色，在200倍荧光显微镜下，每孔随机选取5个视野，观察并计数EdU阳性细胞及总细胞数。通过计算EdU阳性细胞占细胞总数的百分比，明确细胞增殖程度。
1.2.7 Western blotting检测蛋白表达量 向收集的。肾组织／细胞加入裂解液，提取总蛋白，根据Thermo BCA试剂操作手册测定蛋白浓度；根据测定结果加入相应体积的2×SDS Sample Buffer与蛋白质样品混匀，水浴锅95℃孵育10 rain变性；小白鼠解剖器械，利用聚丙稀酰胺凝胶行蛋白电泳，半干法转膜；以1：500的比例稀释VILl抗体，1：1 000稀释caspase 3、p21、Bax、p27和D．actin抗体；将相应硝酸纤维素膜条带置于稀释好的抗体中4℃过夜孵育；采用TBST室温漂洗膜条带8 min(共3次)后，将其放入相应种属来源的二抗(1：1 000)中，室温孵育1 h；孵育后再次使用TBST室温漂洗8 min×3次；混合足昂等体积显色试剂(A和B)，将膜放于玻璃皿中，向其均匀滴加显色剂，利用UVP成像系统显色成像。
1.2.8统计学分析应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计景资料以2+s表示，先进行方筹齐性检验，方差齐者2组问数据比较采用t检验，P<0．05为差异有统计学意义。使用GraphPad Prism 6.0软件生成图表。
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