两种啮齿类动物胶质瘤模型的构建和比较
来源：未知 |发布时间：2018-05-07 09:36|点击:次
摘要:为了开发用于研究脑胶质瘤诊疗新方法的工具,构建和比较了两种侧脑室胶质瘤模型:C6-SD大鼠模型和U87MG裸鼠模型.研究发现两种模型成瘤率都高达100%,其中C6SD大鼠模型成瘤不稳定,表现为:肿瘤转移有个体差异性;在无治疗干预的情况下,短时期内大鼠内肿瘤被清除相对而言,U87MG裸鼠模型成瘤特征稳定,表现为:瘤团大小均一,成瘤时间个体差异小,无肿瘤转移和肿瘤清除等情况因此U87MG-裸鼠模型是适用于开发脑胶质瘤新疗法的工具.
胶质瘤是中枢神经系统最常见而又最难治的恶性肿瘤,约占颅内肿瘤的40%~50%,为了研究胶质瘤的生物学特征和开发抗胶质瘤的新疗法,需要创建稳定的体内胶质瘤模型作为研发工具.当前的脑肿瘤模型大体分为三类,根据获得肿瘤的来源可分为诱发性脑胶质瘤模型、移植脑胶质瘤模型和转基因型脑胶质瘤模型12:诱发性脑胶质瘤模型的遗传机制不清楚,成瘤率、成瘤周期和生物学特征不稳定,决定该模型的应用存在着一定的局限性;转基因型脑胶质瘤模型具有诱发率低、操作复杂、模型构建周期长、成本高等缺陷,也限制了其应用;相对前两种模型,移植脑胶质瘤模型具有较稳定的成瘤概率和生物学特性,且操作较简单,构建周期较短等优势,因此构建稳定的脑移植瘤模型将有助于脑瘤研究和抗脑瘤药物开发。
脑内移植瘤模型分两种:一种是脑瘤细胞移植到同源的动物脑内3,形成肿瘤模型,理论上实验动物的免疫系统对同源性高的肿瘤细胞排斥作用较弱,所以该模型可能成瘤率较高、周期较短以及生物学特征较稳定,甚至可能有肿瘤细胞转移的可能,利用该模型可以研究免疫系统对肿瘤发生和发展的作用,而用该模型开发肿瘤药物便于硏究药物对免疫功能正常动物的副作用;另一种脑移植瘤模型是人源脑瘤细胞移植到实验动物脑内,由于免疫系统对异源细胞的排斥作用,为了构建稳定和髙效的模型,需要选用具免疫缺陷的实验动物作为脑瘤受体4,比如裸鼠和sCID小鼠等S,利用该模型能更准确模拟人源肿瘤在体内的发生和发展过程,以及反映抗肿瘤药物在体内抑制人源肿瘤的效果.本课题构建了两种啮齿类动物的脑内移植胶质瘤模型,一种是大鼠来源胶质瘤细胞——C6细胞移植到SD大鼠脑内的模型,另一种是人源胶质瘤细胞—U87MG细胞系移植到裸鼠脑内的模型,硏究和对比了两种模型的成瘤率、成瘤周期和模型的稳定性等特征,确定了它们的应用价值。
1材料和方法
11实验动物
雄性SD大鼠,年龄6-8周,体重约为200g,购自上海斯莱克实验动物有限公司;雄性裸鼠,年龄6-8周,购自浙江省医学科学院两种实验动物均由杭州师范大学动物中心饲养。
1.2细胞系
大鼠来源的胶质瘤C细胞和人源胶质瘤U87MG细胞均购于中科院上海细胞库,由浙江理工大学生科院李恭楚课题组用含有 Luciferase基因的慢病毒感染细胞,构建了转基因细胞系—C6uc和U87MG-Luc,再由本实验室传代和冷冻保存,用于脑瘤模型的构建C6ue和U87 mg-uc细胞的培养液均为DMEM细胞培养液(购自 Gibco公司),添加体积比为10%的胎牛血清(购自四季青公司)、2mmol/ml谷氨酸(购自 Invitrogen公司)、100U/ml青霉素和链霉素(购自吉诺公司),细胞在37℃、5%CO2及饱和湿度的恒温箱中培养,细胞传代时用025%胰酶(购自 Gibco公司)消化,细胞冻存液为体积比为9:1的胎牛血清和DMSO(购自 Sigma公司)
13脑内移植肿瘤细胞
1.3.1C6细胞植入大鼠侧脑室
腹腔注射用无菌的磷酸缓冲液(无Mg、Ca2)(购自吉诺公司)溶解的水合氯醛(质量体积比为10%)麻醉大鼠,注射量为3ml水合氯醛/kg大鼠,麻醉后将大鼠头部固定于固定架,手术暴露颅骨标志按坐标(前囟后1mm,矢状缝右1.5mm,硬脑膜下4.5mm)用微型钻钻孔后注射细胞按每只鼠1×10°细胞悬液(C6大鼠脑胶质瘤细胞系)15μ于30min内注入靶区,注射完成后留针5min使细胞充分沉积后再缓慢拔针,防止细胞悬液随针返流,针取出后将手术部位擦拭干净并缝合头皮,之后将大鼠放至小电热毯上使其身体回暖,同时观察其心跳以确认存活,待大鼠麻醉消除后将其放回鼠笼,常规饲养.
1.3.2U87MG细胞植入裸鼠侧脑室
腹腔注射用无菌的磷酸缓冲液(无Mg2、Ca2)溶解的戊巴比妥钠(质量体积比为1%)(购自 Sigma公司),0.2μm滤膜过滤除菌后,麻醉裸鼠,注射量为0.25-0.30μ,麻醉后固定头部,切开头皮,暴露颅骨,在标(前囟0mm,矢状缝右0.7mm,硬脑膜下2.5mm)用微型钻钻孔后注射细胞,按每只鼠1×10°细胞悬夜(U87MG人脑胶质瘤细胞系)8-12μl于60min内注入靶区,注射完成后留针10min使细胞充分沉积后再缓慢拔针,防止细胞悬液随针返流,针取出后将手术部位擦拭干净并缝合头皮,之后将裸鼠放至电热毯上苏醒,待裸鼠麻醉消除后将其放回鼠笼。
14肿瘤活体成像
用无菌的磷酸缓冲液(无Mg2、Ca2)配制D茨光素钾盐(购自 Thermo Fisher Scientific公司)工作液15mg/mL),0.2μm滤膜过滤除菌,按10μl/g体重的浓度向每只鼠注射相应量的15mg/mL荧光素溶液,腹腔注射10-15min后用活体成像仪(购自 Caliper Life Sciences公司)扫描动物全身,用相应软件(购自 Caliper Life Sciences公司)进行成像分析,肿瘤大小以成像仪扫描每秒得到总光子数表示,单位是光子/s,脑内移植肿瘤细胞后,每隔5-7d对动物进行成像分析一次。
15苏木精伊红染色
麻醉动物后断颈处死,从颅骨中剥离脑,将脑浸人用磷酸缓冲液配置浓度为4%的多聚甲醛溶液中进行固定,12-24h后,从多聚甲醛溶液中取出脑,将其浸入添加0.5% prolin(购自 Sigma公司)的磷酸缓冲液中,在4℃保藏染色前,从PB溶液中取出脑,用吸水纸吸去表面水分,之后用低熔点琼脂糖(购自Takara biotechnology公司)包埋左半脑,用振动切片机(购自 Leica公司)切片,切片厚度为50um,随后进行木精伊红染色,染色步骤是:将切片置于苏木精溶液(购自南京建成科技有限公司)中约1min,后水漂洗1-2次,再置于伊红溶液(购自南京建成科技有限公司)约10-15min,用水漂洗干净切片上游离的染色剂后贴于载玻片上待切片自然风干后用适量中性树脂(购自 Sigma公司)将切片用盖玻片反压封片,树脂凝固后用倒置显微镜(购自 ZEISS公司)观察拍照。
2.结果
2.1C6SD大鼠胶质瘤模型不稳定
C6细胞是大鼠胶质瘤细胞,源于远交系 Wistar大鼠6,C6- Wistar大鼠模型动物脑瘤模型常用于开发脑瘤新疗法,例如化学治疗8、抗血管治疗9、放射治疗[0和基因治疗[1]等,但是现在实验用的 Wistar大鼠是近交系,与C6细胞的同源性低,导致C6细胞在 Wistar大鼠体内有一定免疫源性,植入细胞数量在104~107内, Wistar大鼠脑内肿瘤生长速率不会随植入细胞数量变化,并且大鼠存活率100%,因此该模型用于研究脑瘤的免疫治疗具有局限性1.SD大鼠是用 Wistar大鼠与其它杂种鼠交配培育而成的白化鼠与C6细胞有一定程度的同源关系,C6SD大鼠模型在移植瘤研究中的应用较少,本研究中我们尝试构建该模型,观察其稳定性,探讨其应用价值移植10°°个C6细胞在SD大鼠脑室内,活体成像仪检测发现其成瘤特征如下:植入细胞10d后原位形成肿瘤,脑瘤形成率100%,15d后肿瘤体积开始缩小,第22d所有移植了C6细胞并产生肿瘤的SD大鼠体内瘤团均消失(图1A和1B),说明虽然C6细胞在SD大鼠脑内能成瘤,但是C6激活SD大鼠体内的免疫反应足够清除已形成的瘤团将成瘤大鼠解剖取脑,脑切片经苏木精伊红染色,结果显示肿瘤细胞核较正常细胞大,瘤团填充了侧脑室,并迁移到脑室背侧的大脑皮层,形成肿瘤灶,正常的大脑皮层中细胞排列有序,而有瘤团的皮层中细胞排列紊乱(图1C),结果显示脑瘤破坏了大脑结构脑室移植肿瘤细胞的SD大鼠中,有1例移植后第15d,肿瘤发生转移,在第22d,肿瘤消失(图1D),暗示C6细胞在SD大鼠侧脑室中可能随着脑脊液循环迁移,从而形成转移病灶,但是SD大鼠的免疫排异能够将转移的肿瘤病灶清除C6SD大鼠模型的存活率是100%,与C6 Wistar大鼠模型一致[12」.综上所述,C6SD大鼠模型移植肿瘤形成的时间和大小较稳定,肿瘤转移情况不稳定,形成的移植瘤在SD大鼠体内被其免疫机能清除,瘤团维持时间短,不是开发脑瘤新疗法的合适模型。
2.2U8TMG-裸鼠模型是稳定的脑胶质瘤模型
U87MG是人源胶质瘤细胞,是脑瘤研究的重要模式细胞,为了防止动物对人源细胞的免疫排异而引起成瘤不稳定,用U87MG构建体内肿瘤模型需要免疫缺陷动物裸鼠是先天性胸腺缺陷小鼠,其体内T淋巴细胞发育障碍,导致免疫机能严重缺损,是人源肿瘤细胞合适的移植受体.本研究将10°个U87MG细胞植入裸鼠侧脑室,观察U87MG在裸鼠脑内能否形成稳定的胶质瘤模型,探讨该模型是否适用于脑瘤生物学研究和新疗法的开发。
裸鼠侧脑室内植入U87MG细胞后,经活体成像仪追踪发现以下成瘤特征:U87MG植人裸鼠侧脑室第10d内,脑内开始出现瘤团,成瘤率达到100%,之后瘤团体积逐步增长,第30d起荷瘤裸鼠开始死亡,并于7d内全部死亡(图2A和2B)解剖荷瘤裸鼠,其脑切片经苏木精伊红染色,结果表明裸鼠的侧脑室被肿瘤细胞填满,瘤团扩张到了大脑皮层(图2C),提示裸鼠死亡的原因可能是瘤团过大引起的脑内压升高研究结果表明:裸鼠从形成肿瘤到死亡的过程中,肿瘤形成和增长速率均一,个体差异较小,除了肿瘤植入位置,裸鼠身体其它部位没有出现转移病灶,U87MG裸鼠模型是高效和稳定的脑瘤模型,是理想的研究脑瘤生物学特征及开发脑瘤新疗法的工具。
3讨论
原位移植胶质瘤模型是将胶质瘤细胞植入实验动物脑内形成脑瘤的实验样本,是研究脑瘤生物学特征和开发肿瘤新疗法及诊断方法的重要工具,理想的脑胶质瘤模型构建简单,具有稳定的成瘤特征以往研究中将胶质瘤细胞注入动物大脑前额皮层,该模型形成瘤团结构规则,利于解剖后观察和比较[134],但是前额皮层是实体组织,移植肿瘤细胞的操作过程中,为了防止因为压力过大破坏皮层,压力过小针头堵塞无法注入细胞,以及细胞注入皮层后空间太小从皮层溢出等情况,操作过程比较复杂且耗时长,并且操作误差大,导致小鼠成瘤个体间差异大本课题为了提高脑瘤模型构建的效率和减少操作误差,将胶质细胞定位植入非实体的侧脑室中,但是在侧脑室中肿瘤形成的瘤团形状不规则,且可能随脑脊液循环发生转移活体成像技术的推广使用,使体内成瘤检测非常便利,即使瘤团形状不规则,也能够在不伤害动物生命的情况下,判断和比较不同个体的瘤团大小和肿瘤转移情况,帮助精确检测脑室成瘤的特征。
本课题构建和比较了两种侧脑室移植脑瘤模型,一种是存在一定同源关系的胶质瘤细胞C6移植到SD大鼠脑部,另一种是人源胶质瘤细胞U87MG移植到免疫缺陷的裸鼠脑部从构建的操作比较,D大鼠头部较大,脑定位手术较精准,其耐受的脑内压范围较大,决定了脑注射速度和流量的可变范围也较大,因此C6SD大鼠模型的操作较U87MC裸鼠模型简单,实验效率较髙.从两种模型的特征比较,它们的应用范畴存在差异.
C6SD大鼠模型中SD大鼠是免疫能力正常的动物,该模型利用的细胞和动物具有低程度的同源性,然而与 Wistar大鼠类似[2,sD大鼠对C6细胞存在免疫排斥,虽然植入肿瘤细胞后成瘤时间稳定,成瘤率为100%,但是SD大鼠荷瘤时间短,消除肿瘤的概率和存活率高达100%,大鼠脑内形成的瘤团在没有药物干预的情况下被清除,如果该模型用于药物开发,很难区分清楚瘤团缩小和消除的原因是SD大鼠的免疫机能还是药效;另外荷瘤SD大鼠的肿瘤转移情况有明显的个体差异,决定了该模型不可用于抗肿瘤转移药物的开发由于形成和消除肿瘤的规律较稳定,因此该模型适用于肿瘤诊断方法的开发,以及可能适用于体内肿瘤细胞具有免疫源性机制的研究.
U87MG裸鼠模型中U87MG是人源胶质瘤细胞,鉴于肿瘤诊疗方法的受益对象是人类患者,U87MG比大鼠来源的C6细胞更能精准的反映新诊疗方法的效果,为了防止实验动物对人源细胞的免疫排异,我们选择免疫缺陷的裸鼠作为荷瘤动物实验结果证明U87MG裸鼠模型成瘤时间稳定,瘤团大小均一,瘤团增长速度和裸鼠死亡时间个体差异小,是理想的肿瘤诊疗新方法开发的模型.该模型没有肿瘤转移发生,因此不适用于研究肿瘤转移特征和开发抗转移药物由于裸鼠胸腺缺失导致T淋巴细胞发育障碍,因此该模型可用于研究促进T淋巴细胞成熟的药物在肿瘤免疫治疗的潜能。
总之,与C6SD大鼠模型比较,U8MG棵鼠模型成瘤率高,瘤团体积、荷瘤时间和肿瘤转移等特征的个体差异小,是比较稳定的脑胶质瘤模型。
胶质瘤是中枢神经系统最常见而又最难治的恶性肿瘤,约占颅内肿瘤的40%~50%,为了研究胶质瘤的生物学特征和开发抗胶质瘤的新疗法,需要创建稳定的体内胶质瘤模型作为研发工具.当前的脑肿瘤模型大体分为三类,根据获得肿瘤的来源可分为诱发性脑胶质瘤模型、移植脑胶质瘤模型和转基因型脑胶质瘤模型12:诱发性脑胶质瘤模型的遗传机制不清楚,成瘤率、成瘤周期和生物学特征不稳定,决定该模型的应用存在着一定的局限性;转基因型脑胶质瘤模型具有诱发率低、操作复杂、模型构建周期长、成本高等缺陷,也限制了其应用;相对前两种模型,移植脑胶质瘤模型具有较稳定的成瘤概率和生物学特性,且操作较简单,构建周期较短等优势,因此构建稳定的脑移植瘤模型将有助于脑瘤研究和抗脑瘤药物开发。
脑内移植瘤模型分两种:一种是脑瘤细胞移植到同源的动物脑内3,形成肿瘤模型,理论上实验动物的免疫系统对同源性高的肿瘤细胞排斥作用较弱,所以该模型可能成瘤率较高、周期较短以及生物学特征较稳定,甚至可能有肿瘤细胞转移的可能,利用该模型可以研究免疫系统对肿瘤发生和发展的作用,而用该模型开发肿瘤药物便于硏究药物对免疫功能正常动物的副作用;另一种脑移植瘤模型是人源脑瘤细胞移植到实验动物脑内,由于免疫系统对异源细胞的排斥作用,为了构建稳定和髙效的模型,需要选用具免疫缺陷的实验动物作为脑瘤受体4,比如裸鼠和sCID小鼠等S,利用该模型能更准确模拟人源肿瘤在体内的发生和发展过程,以及反映抗肿瘤药物在体内抑制人源肿瘤的效果.本课题构建了两种啮齿类动物的脑内移植胶质瘤模型,一种是大鼠来源胶质瘤细胞——C6细胞移植到SD大鼠脑内的模型,另一种是人源胶质瘤细胞—U87MG细胞系移植到裸鼠脑内的模型,硏究和对比了两种模型的成瘤率、成瘤周期和模型的稳定性等特征,确定了它们的应用价值。
1材料和方法
11实验动物
雄性SD大鼠,年龄6-8周,体重约为200g,购自上海斯莱克实验动物有限公司;雄性裸鼠,年龄6-8周,购自浙江省医学科学院两种实验动物均由杭州师范大学动物中心饲养。
1.2细胞系
大鼠来源的胶质瘤C细胞和人源胶质瘤U87MG细胞均购于中科院上海细胞库,由浙江理工大学生科院李恭楚课题组用含有 Luciferase基因的慢病毒感染细胞,构建了转基因细胞系—C6uc和U87MG-Luc,再由本实验室传代和冷冻保存,用于脑瘤模型的构建C6ue和U87 mg-uc细胞的培养液均为DMEM细胞培养液(购自 Gibco公司),添加体积比为10%的胎牛血清(购自四季青公司)、2mmol/ml谷氨酸(购自 Invitrogen公司)、100U/ml青霉素和链霉素(购自吉诺公司),细胞在37℃、5%CO2及饱和湿度的恒温箱中培养,细胞传代时用025%胰酶(购自 Gibco公司)消化,细胞冻存液为体积比为9:1的胎牛血清和DMSO(购自 Sigma公司)
13脑内移植肿瘤细胞
1.3.1C6细胞植入大鼠侧脑室
腹腔注射用无菌的磷酸缓冲液(无Mg、Ca2)(购自吉诺公司)溶解的水合氯醛(质量体积比为10%)麻醉大鼠,注射量为3ml水合氯醛/kg大鼠,麻醉后将大鼠头部固定于固定架,手术暴露颅骨标志按坐标(前囟后1mm,矢状缝右1.5mm,硬脑膜下4.5mm)用微型钻钻孔后注射细胞按每只鼠1×10°细胞悬液(C6大鼠脑胶质瘤细胞系)15μ于30min内注入靶区,注射完成后留针5min使细胞充分沉积后再缓慢拔针,防止细胞悬液随针返流,针取出后将手术部位擦拭干净并缝合头皮,之后将大鼠放至小电热毯上使其身体回暖,同时观察其心跳以确认存活,待大鼠麻醉消除后将其放回鼠笼,常规饲养.
1.3.2U87MG细胞植入裸鼠侧脑室
腹腔注射用无菌的磷酸缓冲液(无Mg2、Ca2)溶解的戊巴比妥钠(质量体积比为1%)(购自 Sigma公司),0.2μm滤膜过滤除菌后,麻醉裸鼠,注射量为0.25-0.30μ,麻醉后固定头部,切开头皮,暴露颅骨,在标(前囟0mm,矢状缝右0.7mm,硬脑膜下2.5mm)用微型钻钻孔后注射细胞,按每只鼠1×10°细胞悬夜(U87MG人脑胶质瘤细胞系)8-12μl于60min内注入靶区,注射完成后留针10min使细胞充分沉积后再缓慢拔针,防止细胞悬液随针返流,针取出后将手术部位擦拭干净并缝合头皮,之后将裸鼠放至电热毯上苏醒,待裸鼠麻醉消除后将其放回鼠笼。
14肿瘤活体成像
用无菌的磷酸缓冲液(无Mg2、Ca2)配制D茨光素钾盐(购自 Thermo Fisher Scientific公司)工作液15mg/mL),0.2μm滤膜过滤除菌,按10μl/g体重的浓度向每只鼠注射相应量的15mg/mL荧光素溶液,腹腔注射10-15min后用活体成像仪(购自 Caliper Life Sciences公司)扫描动物全身,用相应软件(购自 Caliper Life Sciences公司)进行成像分析,肿瘤大小以成像仪扫描每秒得到总光子数表示,单位是光子/s,脑内移植肿瘤细胞后,每隔5-7d对动物进行成像分析一次。
15苏木精伊红染色
麻醉动物后断颈处死,从颅骨中剥离脑,将脑浸人用磷酸缓冲液配置浓度为4%的多聚甲醛溶液中进行固定,12-24h后,从多聚甲醛溶液中取出脑,将其浸入添加0.5% prolin(购自 Sigma公司)的磷酸缓冲液中,在4℃保藏染色前,从PB溶液中取出脑,用吸水纸吸去表面水分,之后用低熔点琼脂糖(购自Takara biotechnology公司)包埋左半脑,用振动切片机(购自 Leica公司)切片,切片厚度为50um,随后进行木精伊红染色,染色步骤是:将切片置于苏木精溶液(购自南京建成科技有限公司)中约1min,后水漂洗1-2次,再置于伊红溶液(购自南京建成科技有限公司)约10-15min,用水漂洗干净切片上游离的染色剂后贴于载玻片上待切片自然风干后用适量中性树脂(购自 Sigma公司)将切片用盖玻片反压封片,树脂凝固后用倒置显微镜(购自 ZEISS公司)观察拍照。
2.结果
2.1C6SD大鼠胶质瘤模型不稳定
C6细胞是大鼠胶质瘤细胞,源于远交系 Wistar大鼠6,C6- Wistar大鼠模型动物脑瘤模型常用于开发脑瘤新疗法,例如化学治疗8、抗血管治疗9、放射治疗[0和基因治疗[1]等,但是现在实验用的 Wistar大鼠是近交系,与C6细胞的同源性低,导致C6细胞在 Wistar大鼠体内有一定免疫源性,植入细胞数量在104~107内, Wistar大鼠脑内肿瘤生长速率不会随植入细胞数量变化,并且大鼠存活率100%,因此该模型用于研究脑瘤的免疫治疗具有局限性1.SD大鼠是用 Wistar大鼠与其它杂种鼠交配培育而成的白化鼠与C6细胞有一定程度的同源关系,C6SD大鼠模型在移植瘤研究中的应用较少,本研究中我们尝试构建该模型,观察其稳定性,探讨其应用价值移植10°°个C6细胞在SD大鼠脑室内,活体成像仪检测发现其成瘤特征如下:植入细胞10d后原位形成肿瘤,脑瘤形成率100%,15d后肿瘤体积开始缩小,第22d所有移植了C6细胞并产生肿瘤的SD大鼠体内瘤团均消失(图1A和1B),说明虽然C6细胞在SD大鼠脑内能成瘤,但是C6激活SD大鼠体内的免疫反应足够清除已形成的瘤团将成瘤大鼠解剖取脑,脑切片经苏木精伊红染色,结果显示肿瘤细胞核较正常细胞大,瘤团填充了侧脑室,并迁移到脑室背侧的大脑皮层,形成肿瘤灶,正常的大脑皮层中细胞排列有序,而有瘤团的皮层中细胞排列紊乱(图1C),结果显示脑瘤破坏了大脑结构脑室移植肿瘤细胞的SD大鼠中,有1例移植后第15d,肿瘤发生转移,在第22d,肿瘤消失(图1D),暗示C6细胞在SD大鼠侧脑室中可能随着脑脊液循环迁移,从而形成转移病灶,但是SD大鼠的免疫排异能够将转移的肿瘤病灶清除C6SD大鼠模型的存活率是100%,与C6 Wistar大鼠模型一致[12」.综上所述,C6SD大鼠模型移植肿瘤形成的时间和大小较稳定,肿瘤转移情况不稳定,形成的移植瘤在SD大鼠体内被其免疫机能清除,瘤团维持时间短,不是开发脑瘤新疗法的合适模型。
2.2U8TMG-裸鼠模型是稳定的脑胶质瘤模型
U87MG是人源胶质瘤细胞,是脑瘤研究的重要模式细胞,为了防止动物对人源细胞的免疫排异而引起成瘤不稳定,用U87MG构建体内肿瘤模型需要免疫缺陷动物裸鼠是先天性胸腺缺陷小鼠,其体内T淋巴细胞发育障碍,导致免疫机能严重缺损,是人源肿瘤细胞合适的移植受体.本研究将10°个U87MG细胞植入裸鼠侧脑室,观察U87MG在裸鼠脑内能否形成稳定的胶质瘤模型,探讨该模型是否适用于脑瘤生物学研究和新疗法的开发。
裸鼠侧脑室内植入U87MG细胞后,经活体成像仪追踪发现以下成瘤特征:U87MG植人裸鼠侧脑室第10d内,脑内开始出现瘤团,成瘤率达到100%,之后瘤团体积逐步增长,第30d起荷瘤裸鼠开始死亡,并于7d内全部死亡(图2A和2B)解剖荷瘤裸鼠,其脑切片经苏木精伊红染色,结果表明裸鼠的侧脑室被肿瘤细胞填满,瘤团扩张到了大脑皮层(图2C),提示裸鼠死亡的原因可能是瘤团过大引起的脑内压升高研究结果表明:裸鼠从形成肿瘤到死亡的过程中,肿瘤形成和增长速率均一,个体差异较小,除了肿瘤植入位置,裸鼠身体其它部位没有出现转移病灶,U87MG裸鼠模型是高效和稳定的脑瘤模型,是理想的研究脑瘤生物学特征及开发脑瘤新疗法的工具。
3讨论
原位移植胶质瘤模型是将胶质瘤细胞植入实验动物脑内形成脑瘤的实验样本,是研究脑瘤生物学特征和开发肿瘤新疗法及诊断方法的重要工具,理想的脑胶质瘤模型构建简单,具有稳定的成瘤特征以往研究中将胶质瘤细胞注入动物大脑前额皮层,该模型形成瘤团结构规则,利于解剖后观察和比较[134],但是前额皮层是实体组织,移植肿瘤细胞的操作过程中,为了防止因为压力过大破坏皮层,压力过小针头堵塞无法注入细胞,以及细胞注入皮层后空间太小从皮层溢出等情况,操作过程比较复杂且耗时长,并且操作误差大,导致小鼠成瘤个体间差异大本课题为了提高脑瘤模型构建的效率和减少操作误差,将胶质细胞定位植入非实体的侧脑室中,但是在侧脑室中肿瘤形成的瘤团形状不规则,且可能随脑脊液循环发生转移活体成像技术的推广使用,使体内成瘤检测非常便利,即使瘤团形状不规则,也能够在不伤害动物生命的情况下,判断和比较不同个体的瘤团大小和肿瘤转移情况,帮助精确检测脑室成瘤的特征。
本课题构建和比较了两种侧脑室移植脑瘤模型,一种是存在一定同源关系的胶质瘤细胞C6移植到SD大鼠脑部,另一种是人源胶质瘤细胞U87MG移植到免疫缺陷的裸鼠脑部从构建的操作比较,D大鼠头部较大,脑定位手术较精准,其耐受的脑内压范围较大,决定了脑注射速度和流量的可变范围也较大,因此C6SD大鼠模型的操作较U87MC裸鼠模型简单,实验效率较髙.从两种模型的特征比较,它们的应用范畴存在差异.
C6SD大鼠模型中SD大鼠是免疫能力正常的动物,该模型利用的细胞和动物具有低程度的同源性,然而与 Wistar大鼠类似[2,sD大鼠对C6细胞存在免疫排斥,虽然植入肿瘤细胞后成瘤时间稳定,成瘤率为100%,但是SD大鼠荷瘤时间短,消除肿瘤的概率和存活率高达100%,大鼠脑内形成的瘤团在没有药物干预的情况下被清除,如果该模型用于药物开发,很难区分清楚瘤团缩小和消除的原因是SD大鼠的免疫机能还是药效;另外荷瘤SD大鼠的肿瘤转移情况有明显的个体差异,决定了该模型不可用于抗肿瘤转移药物的开发由于形成和消除肿瘤的规律较稳定,因此该模型适用于肿瘤诊断方法的开发,以及可能适用于体内肿瘤细胞具有免疫源性机制的研究.
U87MG裸鼠模型中U87MG是人源胶质瘤细胞,鉴于肿瘤诊疗方法的受益对象是人类患者,U87MG比大鼠来源的C6细胞更能精准的反映新诊疗方法的效果,为了防止实验动物对人源细胞的免疫排异,我们选择免疫缺陷的裸鼠作为荷瘤动物实验结果证明U87MG裸鼠模型成瘤时间稳定,瘤团大小均一,瘤团增长速度和裸鼠死亡时间个体差异小,是理想的肿瘤诊疗新方法开发的模型.该模型没有肿瘤转移发生,因此不适用于研究肿瘤转移特征和开发抗转移药物由于裸鼠胸腺缺失导致T淋巴细胞发育障碍,因此该模型可用于研究促进T淋巴细胞成熟的药物在肿瘤免疫治疗的潜能。
总之,与C6SD大鼠模型比较,U8MG棵鼠模型成瘤率高,瘤团体积、荷瘤时间和肿瘤转移等特征的个体差异小,是比较稳定的脑胶质瘤模型。
下一篇：啮齿类动物脊髓损伤模型的研究现状
