人工骨修复兔桡骨缺损的临床研究
来源：未知 |发布时间：2022-12-19 10:14|点击:次
人工骨修复兔桡骨缺损的临床研究
骨缺损是临床上常见的一种疾病，主要表现为骨结构的完整性被破坏，是目前骨科临床治疗的难题之一。创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因。如何对各种原因引起的骨缺损进行有效的修复是现阶段研究的主要方向。
低氧诱导因子-1（hypoxia⁃inducible factor⁃1,HIF⁃1）是Semenza等于1992年发现的一种氧依赖转录激活因子，通过与低氧反应元件（HRE）结合，引发下游基因转录，通过对其下游靶基因的诱导表达，调控血管生成、能量代谢、细胞增殖迁移分化等反应。大量体外和体内实验研究报道都证实了HIF⁃1α在促进血管化及成骨化方面有着积极的作用。张劲娥等构建了野生型和点突变型HIF⁃1α基因慢病毒真核表达载体，并转染兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs），发现其转染后可促进兔BMSCs成骨基因的表达。Ding等将HIF⁃1α基因转染到BMSCs中，并移植入早期激素性股骨头坏死家兔模型中，结果表明HIF⁃1α基因转染可提高离体骨髓细胞成骨相关基因mRNA的表达，在体外增强成骨细胞的活性，在体内增强血管生成活性，说明HIF⁃1α转基因自体骨髓干细胞转移可以促进激素性股骨头坏死区的修复。
BMSCs是存在于骨髓中的一类非造血干细胞，在一定条件下可定向分化为多种细胞，如脂肪细胞、软骨细胞或成骨细胞等。纳米羟基磷灰石（nano⁃hydroxyapatite,nano⁃HA）是目前应用广泛的一种生物活性材料，具有良好的骨传导性和生物相容性。本研究将重组HIF⁃1α慢病毒质粒感染BMSCs后，与nano⁃HA人工骨复合培养，使骨修复材料具备良好骨传导和骨诱导性能，并通过动物实验对复合人工骨的修复能力进行检测，以此解决人工骨修复材料在骨缺损区与周边自体骨之间有效“骨整合”的难题，从而为临床修复骨缺损提供一些实验依据。
材料与方法
一、材料与试剂
慢病毒HIF⁃1α表达质粒、293T细胞、nano⁃HA人工骨（孔隙直径为150~300μm、孔隙率为92%以上）由深圳市第二人民医院组织工程实验室制备提供；新西兰大白兔，雄雌不限，2月龄（2 kg左右），由深圳市疾病预防控制中心提供。
Lenti⁃Pac HIV表达包装试剂盒，H⁃DMEM培养基、PBS缓冲液，Opti⁃MEMI、0.25%Trypsin⁃EDTA、胎牛血清（FBS）、双抗（青霉素+链霉素）、噻唑蓝、二甲基亚砜，Anti⁃CD90/FITC、Anti⁃CD105/FITC、Anti⁃CD45/FITC、Anti⁃CD34/FITC、维生素C、3-甘油磷酸钠、地塞米松、胰岛素、戊巴比妥钠、番红、素木精、快绿。
二、兔BMSCs的分离、培养和鉴定
1.分离和培养新西兰大白兔静脉注射2%戊巴比妥钠，全身麻醉，局部去毛、消毒，于兔后腿股骨大转子处行骨髓穿刺，将5 ml注射器预装0.1 ml肝素，抽取约3 ml骨髓。离心、洗涤。将洗涤后的细胞悬液加入5 ml含有10%FBS、1%双抗的H⁃DMEM培养液中，置于直径75 mm的培养皿中，5%CO 2和37℃培养箱中培养。48 h后首次换液，之后每2~3 d换液1次。
2.形态鉴定待贴壁生长的细胞集落达到85%~90%融合时，用0.25%胰酶消化细胞，按1∶2比例传代培养，每2~3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态。
3.表面标记鉴定取第3代生长状态良好、处于对数生长期的兔BMSCs。洗涤，离心，计数，将细胞浓度调整为5×10 6个/ml。取100μl细胞悬液，分别加入20μl Anti⁃CD90/FITC、Anti⁃CD105/FITC、Anti⁃CD45/FITC、Anti⁃CD34/FITC，避光室温孵育20 min，PBS液洗涤细胞，1 000 r/min，离心5 min。加入PBS液400μl，重悬细胞，流式细胞仪进行检测，使用Beckman Coulter软件采集数据。
使用Beckman Coulter软件采集数据。
上一篇：啮齿类动物实验结果讨论
