实验小白鼠解剖器械在实验室的应用
来源：未知 |发布时间：2021-03-17 09:34|点击:次
利用CRISPR/Cas9 AAV系统构建纹状体SIc20a2基因敲除小鼠模型
原发性家族性脑钙化症(primary familial braincalcificationP）化为特征的神经系统选R旅碍、床主要表现为运动障碍、精神症状、认知障碍、撷且具有高度遗传异质性。
迄今为止，已明确有6个PFBC致病基因:.SLC20AE中.sL.C2042基因被认为是 PFBC最常见的致病基因，该基因编码I1I型钠-磷协同转运体2(PiT2)，突变后严重影响磷的摄取功能,引起细胞外颌股问PFE致病基因.但钙磷沉积。虽然已克隆多个PFBC致病基因,但该病仍缺乏有效的治疗手段，具体的发病机制及治疗方法仍需进一步探讨。
动物模型是模拟疾病表型、研究疾病机制及探索治疗手段的良好工具。SLC20A2为管家基因，在胎生长受限,且部分新生小鼠会在断奶前死亡PFBC患者的病理性钙化巴部位因此,构建纹状体SIc20a2基因餐除小象锅出长限的困境,而Slc20a2基因全身敲除小鼠胚胎生长受限的困境,而且能够特异性地研究纹状体区域脑钙化具体机制。
CRISPRJCas9系统由于具备效率高、设计简单等优势。是目前最为广泛运用的基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统包含两大组分：一是行使剪切功能的Cas9蛋白;另一个是特异性引导Cas9蛋白至靶DNA序列的sgRNA(single guide RNA).由于Cas9蛋白分子量较大.且血脑屏障的存在使得Cas9蛋白病毒载体在神经系统中不易于表达。LSL-Cas9-EGFP
性表达Cas9蛋白和EGFP蛋白。通过向小鼠脑区或者核团注射sgRNA和Cre，可以激活LSL-Cas9-EGFP小鼠表达 Cas9蛋白，从面实现定点目的基因LSL-Cas9-EGFP小鼠,进行纹状体Slc20a2基因条件性敲除，为 PFBC的发病机制及药物研究提供良好的动物模型。
1材料与方法
1.1材料
实验中所用小鼠为条件性表达 Cas9及 EGFP蛋白小鼠(LSL-Cas9-EGFP鼠,B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-Loxp-Stop-LoxP-Cas9,-EGFP)Fezh/J)。AAV病毒表达载体(60229,AAV:ITR-U6-sgRNA-backbonc-pCBh-Cre-WPRE-hGHpA-ITR)，含Cre位点以及两个Sap I爵切位点。Reporter质粒(20299,pAAV-EF1a-double floxed-mCherry-WPRE-HGHpA),其中两个flox序列是反向插入，可条件性表达红色荧光蛋白。实验室常规保存质粒px458(Cas9/sgRNA/EGFP共同表达质粒)含BbsI酶切位点。T4 DNA连接酶、Sap 1、Bbs l等核酸内切酶,细胞株为小鼠神经瘤母细胞N2A细胞、293T细胞。
1.2sgRNA设计和寡核苷酸链合成
根据CRISPR/Cas9系统sgRNA设计原则,使用Zhang lab对鼠源Slc20a2基因(Gene ID: 20516)第3外显子(290~429 bp)设计靶点,选择敲除效率分数最高的3个sgRNA(sgRNAl、 sgRNA2、sgRNA3)。
sgRNA序列若不以G碱基开头,可添加1个G碱基以便U6启动子转录。在合成sgRNA 时需在序列里添加5'-cacc-3'和5'-aaac-3’，使其退火后形成可与Bbs1酶切位点互补的粘性末端。根据靶位点设计扩增引物，分别为 E3F:5'-TGACTCATCATTGG-CACAGG-3和E3R:5-TAAGGCTCTTCTTCACGT-GG-3'，扩增长度为650 bp。sgRNAl、 sgRNA2和sgRNA3切剃后产物大小分别约为297 bp和l 353 bp .288 bp和 362 bp、248 bp和402 bp。
1.3构建Slc20a2基因px458-sgRNA打靶载体
实验所用质粒载体为px458，使用Bbs Ⅰ限制性内切酶酶切，37℃水浴1 h，按照胶回收试剂盒说明书回收约9300 bp长度的DNA片段。将合成的sgRNA的上游(F)和下游(R)引物用退火缓冲液稀释至9 mmol/L,用PCR仪退火,程序为95℃ 5 min,72℃ 10 min，37℃ 20 min，即退火为双链 DNA,用于后续连接反应。退火后的 sgRNA寡核苷酸双链与回收的 px458载体片段在T4 DNA连接酶作用下16℃过夜连接,连接产物转化至DH5α感受态，挑取单克隆菌落并提取质粒 px458-sgRNAl 、 px458-sgRNA2和px458-sgRNA3，通过一代测序验证将sgRNA序列克隆到px458质粒中。
此文字最终解释权归河南宜慧康科技有限公司所有：详情请咨询河南宜慧康科技有限公司。
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