啮齿类动物脊髓损伤模型的研究现状
来源：未知 |发布时间：2018-11-03 09:19|点击:次
摘要:目前已经成功建立了多种脊髓损伤(sCⅠ动物模型,可从不同角度模拟临床脊髓损伤。脊髓损伤模型主要有脊髓挫伤模型、压迫损伤模型、橫断损伤模型、缺血再灌注损伤模型和光化学损伤模型等几种。笔者对哦齿类动物几种脊髓损伤模型的原理制作方法及其特点分别进行了介绍。
自1911年Alen利用重物坠落法首先制作了脊髓挫伤模型之后,脊髓损伤( spinal cord injury,sC)动物模型的研究不断发展成熟,目前已经成功建立了多种动物模型,可从不同角度模拟临床SCl。建立标准、理想的脊髓损伤模型是研究sCI最基本的条件,笔者现就几种常见的啮齿类动物SCl模型的原理制作方法及优缺点综述如下。
啮齿类动物SCI模型概况sCI动物模型涉及兔、猫、犬、猪、灵长类等多种动物,以啮齿类动物应用最广。其中大鼠对剧烈损伤耐受力最强,病理改变与人接近,形成空洞,术后易管理,感染率低,应用最多。而小鼠体形小不易操作,术后多形成致密结缔组织,病理改变与大鼠及人类有所区别,应用受到一定限制,但因其在转基因研究中所具有的优势,其应用也越来越广。
SCI多为脊柱骨性结构侵犯脊髓的直接后果,损伤程度与早期原发伤及其继发病理改变有关。常见SCI模型分为挫伤、压伤、横断伤及缺血再灌注损伤、光化学损伤等,其中挫伤、压伤模型属于钝性损伤,适合SCI后继发性病理生理改变的研究;横断伤模型属切割伤,适用于轴突再生的研究。SCI模型的评价主要从解剖和功能2个方面进行,解剖上主要采用包括束路追踪在内的组织学技术,功能上主要运用神经生理学及多种运动和感觉量表。
临床SC伤情多变,损伤机制复杂,任何一种模型都不能完全模拟临床SCI,不同模型适用于不同研究目的。如挫伤模型适用于研究sCⅠ后生理反应或继发损伤的病理生理改变;压伤模型适用于脊髓受压后改变或减压治疗的研究;切割伤模型适用于脊髓再生的研究。有些研究需采用多种模型,如药物治疗促进脊髓再生的研究,可先釆用脊髓横断模型对冉生轴突进行证实,再利用挫伤模型研究最佳治疗方案。此外护理工作也是选择动物模型时必须考虑的重要因素。其它因素还包括动物脊柱手术的训练、适宜的仪器设备等。理想的sCI模型应具有较好的临床再现性、损伤程度的可调控性、较高的可操作性与可复制性。
2啮齿类动物钝性SCI模型原理及特点钝性挫伤或压伤模型接近人类脊髓受伤的实际,是研究sCI的良好模型。一是病理改变接近临床。早期表现为损伤部位弥漫性出血、坏死和水肿,随后部分组织修复再生;慢性期表现为脊髓实质娄缩、胶质瘢痕增生和中央囊腔形成。二是钝性损伤模型损伤区边缘脊髓组织也保持完好,残存白质数量与运动功能的保留程度一致2。
2.1脊髓挫伤模型1911年Alen利用重物坠落法首先制作了sCl脊髓挫伤模型,该方法后来被称为Alen打击法。其原理为利用机械力撞击脊髓,使脊髓在应力作用下产生弹性变而致伤。方法为暴露背侧脊髓,保留硬脊膜,用标准质量重物沿中空导管自由落下,通过改变下落高度造成不同程度损伤。脊髓致伤能量采用重物质量(gm)与下落高度(cm)的乘积(单位g或g)来衡量。
该模型的优点在于成本低,易操作,损伤平面明确,损伤后病理改变和功能障碍较典型,损伤程度可调节,轻、重度损伤可重复性好,感染机会较小。比较研究2证实了大鼠脊髓重物坠落损伤模型在形态学、功能改变和电生理检査与临床实际相一致,表明挫伤模型是研究SCI后形态功能改变以及治疗方法的良好模型。该方法缺点在于致伤模型影响因素多,需切除椎板,易损伤脊髓血管和脊神经;撞击部位不易精确确定,脊髓受压瞬间压强变化可比性差;重物反弹可使脊髓受多次打击,中度损伤可重复性差等。
Alen打击法进行了许多改进,近年来增加了计算机辅助冲击仪,通过调节冲击仪的生物力学参数逐渐增加损伤的程度。 Falconer等“利用立体定位仪调节大鼠脊髓位置,通过计算机控制电子反馈装置检测调节脊髓受压参数,有效避免了脊髓遺受多次打击,确保了模型的一致性。目前纽约大学( New York University,NYU)冲击仪和俄亥俄州大学(OhioState University,OSU)冲击仪应用较广3。NYU冲击仪采用10g冲击棒分别从6.25、12.5、25和50mm不同高度落下,打击大鼠暴露的T,-T脊髓背面,并固定上下位椎体的嵴突以减少冲击时脊椎的活动。该装置可精确测量多项生物力学参数,包括冲击棒冲击速度、脊髓被压缩距离、压缩率及所受应力,并可剔除超出预定受力范围的动物。此外该模型还要求控制其它如动物种系、年龄、麻醉方法、麻醉至撞击时间等条件,从而制作病理学和功能的连贯性损伤。O5U冲击仪采用了计算机反馈控制机电冲击仪而非重物坠落法。将冲击头缓慢旋转与硬膜表面接触,以大约3000达因的力产生30μm的位移,保证了损伤的起始点相同;之后冲击头在10分钟内快速冲击脊髓产生一定位移(一般为0.8-1.1mm),保持约4-5分钟,在10分钟内释放。该方法由于主动撤去冲击头,避免了重物弹起后下落造成的二次损伤,并通过传感器测量脊髓受力和位移的大小,可剔除超出预定标准的模型。Sche等6对0sU冲击仪进行了进一步改进,改变了通过脊髓位移调节损伤程度的方法,通过控制冲击仪冲击力的大小而造成不同程度的损伤,日前这种经改进的冲击仪和Ohio冲击仪都可用于制作小鼠SCl模型。
2.2脊髓压迫损伤模型该模型应用也较广泛,有多种致伤方法,分别利用动脉夹、球囊、重物或带旋转螺钉的压板造成脊髓压迫损伤,其原理是利用压力作用影响脊髓组织及其血供造成损伤。其中动脉夹和球囊压迫损伤最为常见,制作容易,可准确控制压伤的范围和程度,缺点是与实际SCI相关性较差。
2.2.1钳夹压迫损伤模型利用特制动脉夹垂直钳夹于暴露的脊髓,通过调整钳夹力和作用时间可制作不同程度的sCI模型。 borgens发现使用改进的手术镊子持续挤压大鼠脊髓15秒,使之产生恒定位移,制作的SCI模型可重复性较好。 Joshi等”针对小鼠脊髓的特点改进了动脉夹尺寸使用不同的弹簧以产生不同的夹持力,并定期校正以保持夹持力的恒定,在硬膜外夹持1分钟以造成SCI,结果发现该方法制作的模型具有微囊腔、轴突变性和显著的星形细胞反应性胶质化等sCI的典型表现。该方法的优点类同于挫伤模型,可保持硬脊膜完整,SCI后的解剖结构与神经功能的变化也与挫伤模型近似。
2.2.2球囊压迫损伤模型球囊压迫模型可模拟临床椎管内脊髓压迫病变。损伤原理为脊髓受压造成组织缺血低氧,以及机械压力的作用所造成的脊髓组织直接损伤。张峡等采用大鼠脊髓腹侧椎管内放置不同规格水囊制作了脊髓腹侧压迫损伤模型,在固定压迫时间和致伤速度的前提下,通过改变水囊体积成功地制作出不同程度的脊髓损伤较好地反应了脊髓压迫患者的基本伤情及特点。该方法优点为闭合性损伤,持续时间可控,重复性好,可准确制作轻、中、重不同程度SCI模型,特别适用于药物及减压手术的治疗研究。
V nicky等1通过T椎弓钻孔将 Fogarty导管插入大鼠T水平硬膜外间隙,改变注入水量制作不同程度损伤作者认为注水量为15μ对研究SI的病理生理及治疗的保护作用效果最佳。 Sheng等将硅酮管垂直于脊柱纵轴置于T硬膜外间隙,根据硅管保留时间不同造成不同程度的损伤。
2.3脊髓橫断损伤模型横断模型多为切割伤,主要用于sCI再生与修复等研究。该方法多采用锐利刀片横断或半横断脊髓,或切除脊髓部分节段、或吸除部分组织造成脊髓横断性缺损完全横断模型适合轴突再生和功能恢复的评价。一般认为,脊髓完全横断后,如顺行追踪观察到远端标记轴突,则意味着轴突成功再生,也是动物功能恢复的原因。这种观点受到广泛认可,成为完全横断模型的主要优势,但该观点也面临一定的挑战,因为脊髓全横断动物经过重力辅助后肢平板训练或鞘内注射肾上腺素激动剂后可恢复一定功能,并且减少横断脊髓移位导致的硬膜损伤和成纤维细胞浸润,在不采取任何干预措施的情况下,脊髓全横断的成年小鼠可以部分恢复功能。如果实施特定疗法后,脊髓全横断动物功能均可恢复,再次横断后恢复功能消失,那说明这种恢复是由于下行传导束轴突再生引起的。该模型的主要优点是操作简便、重复性好,造成的功能障碍直接归因于脊髓横断原发损伤,对脊髓损伤修复的研究很有价值;缺点是临床患者很少发生脊髓完全离断,且术后动物死亡率高,护理难度大,不利于慢性损伤再生的研究。
部分横断模型可以选择性切断脊髓,制作轻度神经功能障碍,术后易管理,避免了脊髓全横断所致的高死亡率及膀胱储留等问题,利于长时间实验观察,在脊髓再生的研究中具有重要价值。单侧半切模型可利用健侧作为对照进行病理学及移植再生效应的研究,特别是挖制肢体熟练运动的大鼠红核脊髓束在对侧脊髓背外侧柱中下行,容易完全切断侧并使对侧保持完整。背側半横切模型"则容易切断双侧红核脊髓和中央管背侧皮质脊髓束。但部分横切模型也存在一定问题,如很难区分术后功能改善是由于受损传导路再生还是残余组织功能代偿。
2.4啮齿类动物其它SCI模型
2.4.1脊髓缺血再灌注损伤模型该模型最早用于大型动物SC的研究。大鼠脊髓供血主要来自胸主动脉,可采用左锁骨下动脉分支远端阻断胸主动脉或肾下主动脉的方法制作。该模型具有手术简便、并发症少等优点,主要弊端是与临床SCl相关性差,不易控制SCI程度,重复性较差。
2.4.2光化学损伤模型该模型通过激光照射脊髓特定部位1,静脉注射的光敏剂在激光作用下发生化学反应,造成局部氧自由基堆积,脊髓血管内皮细胞受损,引起血栓,导致脊髓缺血损伤和水肿。该方法避免了侵入性操作,保持了脊髓的完整,但光的热效应对脊髓造成的直接损伤对实验研究有一定影响。光化学损伤后小鼠脊髓无空洞形成,而是形成致密结缔组织,损伤组织病理改变和免疫组化结果与小鼠功能受损程度相一致。
实验模型与临床SCI发生的环境有很大不同,如实验动物SCl是在麻醉条件下进行的,而临床患者使用了多种药物使得神经保护剂研究的药物环境不同,即使同一种模型不同品系的动物所产生的SCI效应也不尽相同-0。但正是动物模型的不断发展和完善促进了人们对SCl病理生理机制研究的逐步深入。需要指出的是不同的模型是针对解决不同的问题而建立的,因此每种模型都有其优缺点,任何一种动物模型都不可能完全再现临床SCI错综复杂的病理生理表现,而恰恰是多种不同的动物模型深化了我们对SCI的理解。在实验过程中,应综合考虑多种影响因素,根据实验目的选择一种或多种动物模型。
自1911年Alen利用重物坠落法首先制作了脊髓挫伤模型之后,脊髓损伤( spinal cord injury,sC)动物模型的研究不断发展成熟,目前已经成功建立了多种动物模型,可从不同角度模拟临床SCl。建立标准、理想的脊髓损伤模型是研究sCI最基本的条件,笔者现就几种常见的啮齿类动物SCl模型的原理制作方法及优缺点综述如下。
啮齿类动物SCI模型概况sCI动物模型涉及兔、猫、犬、猪、灵长类等多种动物,以啮齿类动物应用最广。其中大鼠对剧烈损伤耐受力最强,病理改变与人接近,形成空洞,术后易管理,感染率低,应用最多。而小鼠体形小不易操作,术后多形成致密结缔组织,病理改变与大鼠及人类有所区别,应用受到一定限制,但因其在转基因研究中所具有的优势,其应用也越来越广。
SCI多为脊柱骨性结构侵犯脊髓的直接后果,损伤程度与早期原发伤及其继发病理改变有关。常见SCI模型分为挫伤、压伤、横断伤及缺血再灌注损伤、光化学损伤等,其中挫伤、压伤模型属于钝性损伤,适合SCI后继发性病理生理改变的研究;横断伤模型属切割伤,适用于轴突再生的研究。SCI模型的评价主要从解剖和功能2个方面进行,解剖上主要采用包括束路追踪在内的组织学技术,功能上主要运用神经生理学及多种运动和感觉量表。
临床SC伤情多变,损伤机制复杂,任何一种模型都不能完全模拟临床SCI,不同模型适用于不同研究目的。如挫伤模型适用于研究sCⅠ后生理反应或继发损伤的病理生理改变;压伤模型适用于脊髓受压后改变或减压治疗的研究;切割伤模型适用于脊髓再生的研究。有些研究需采用多种模型,如药物治疗促进脊髓再生的研究,可先釆用脊髓横断模型对冉生轴突进行证实,再利用挫伤模型研究最佳治疗方案。此外护理工作也是选择动物模型时必须考虑的重要因素。其它因素还包括动物脊柱手术的训练、适宜的仪器设备等。理想的sCI模型应具有较好的临床再现性、损伤程度的可调控性、较高的可操作性与可复制性。
2啮齿类动物钝性SCI模型原理及特点钝性挫伤或压伤模型接近人类脊髓受伤的实际,是研究sCI的良好模型。一是病理改变接近临床。早期表现为损伤部位弥漫性出血、坏死和水肿,随后部分组织修复再生;慢性期表现为脊髓实质娄缩、胶质瘢痕增生和中央囊腔形成。二是钝性损伤模型损伤区边缘脊髓组织也保持完好,残存白质数量与运动功能的保留程度一致2。
2.1脊髓挫伤模型1911年Alen利用重物坠落法首先制作了sCl脊髓挫伤模型,该方法后来被称为Alen打击法。其原理为利用机械力撞击脊髓,使脊髓在应力作用下产生弹性变而致伤。方法为暴露背侧脊髓,保留硬脊膜,用标准质量重物沿中空导管自由落下,通过改变下落高度造成不同程度损伤。脊髓致伤能量采用重物质量(gm)与下落高度(cm)的乘积(单位g或g)来衡量。
该模型的优点在于成本低,易操作,损伤平面明确,损伤后病理改变和功能障碍较典型,损伤程度可调节,轻、重度损伤可重复性好,感染机会较小。比较研究2证实了大鼠脊髓重物坠落损伤模型在形态学、功能改变和电生理检査与临床实际相一致,表明挫伤模型是研究SCI后形态功能改变以及治疗方法的良好模型。该方法缺点在于致伤模型影响因素多,需切除椎板,易损伤脊髓血管和脊神经;撞击部位不易精确确定,脊髓受压瞬间压强变化可比性差;重物反弹可使脊髓受多次打击,中度损伤可重复性差等。
Alen打击法进行了许多改进,近年来增加了计算机辅助冲击仪,通过调节冲击仪的生物力学参数逐渐增加损伤的程度。 Falconer等“利用立体定位仪调节大鼠脊髓位置,通过计算机控制电子反馈装置检测调节脊髓受压参数,有效避免了脊髓遺受多次打击,确保了模型的一致性。目前纽约大学( New York University,NYU)冲击仪和俄亥俄州大学(OhioState University,OSU)冲击仪应用较广3。NYU冲击仪采用10g冲击棒分别从6.25、12.5、25和50mm不同高度落下,打击大鼠暴露的T,-T脊髓背面,并固定上下位椎体的嵴突以减少冲击时脊椎的活动。该装置可精确测量多项生物力学参数,包括冲击棒冲击速度、脊髓被压缩距离、压缩率及所受应力,并可剔除超出预定受力范围的动物。此外该模型还要求控制其它如动物种系、年龄、麻醉方法、麻醉至撞击时间等条件,从而制作病理学和功能的连贯性损伤。O5U冲击仪采用了计算机反馈控制机电冲击仪而非重物坠落法。将冲击头缓慢旋转与硬膜表面接触,以大约3000达因的力产生30μm的位移,保证了损伤的起始点相同;之后冲击头在10分钟内快速冲击脊髓产生一定位移(一般为0.8-1.1mm),保持约4-5分钟,在10分钟内释放。该方法由于主动撤去冲击头,避免了重物弹起后下落造成的二次损伤,并通过传感器测量脊髓受力和位移的大小,可剔除超出预定标准的模型。Sche等6对0sU冲击仪进行了进一步改进,改变了通过脊髓位移调节损伤程度的方法,通过控制冲击仪冲击力的大小而造成不同程度的损伤,日前这种经改进的冲击仪和Ohio冲击仪都可用于制作小鼠SCl模型。
2.2脊髓压迫损伤模型该模型应用也较广泛,有多种致伤方法,分别利用动脉夹、球囊、重物或带旋转螺钉的压板造成脊髓压迫损伤,其原理是利用压力作用影响脊髓组织及其血供造成损伤。其中动脉夹和球囊压迫损伤最为常见,制作容易,可准确控制压伤的范围和程度,缺点是与实际SCI相关性较差。
2.2.1钳夹压迫损伤模型利用特制动脉夹垂直钳夹于暴露的脊髓,通过调整钳夹力和作用时间可制作不同程度的sCI模型。 borgens发现使用改进的手术镊子持续挤压大鼠脊髓15秒,使之产生恒定位移,制作的SCI模型可重复性较好。 Joshi等”针对小鼠脊髓的特点改进了动脉夹尺寸使用不同的弹簧以产生不同的夹持力,并定期校正以保持夹持力的恒定,在硬膜外夹持1分钟以造成SCI,结果发现该方法制作的模型具有微囊腔、轴突变性和显著的星形细胞反应性胶质化等sCI的典型表现。该方法的优点类同于挫伤模型,可保持硬脊膜完整,SCI后的解剖结构与神经功能的变化也与挫伤模型近似。
2.2.2球囊压迫损伤模型球囊压迫模型可模拟临床椎管内脊髓压迫病变。损伤原理为脊髓受压造成组织缺血低氧,以及机械压力的作用所造成的脊髓组织直接损伤。张峡等采用大鼠脊髓腹侧椎管内放置不同规格水囊制作了脊髓腹侧压迫损伤模型,在固定压迫时间和致伤速度的前提下,通过改变水囊体积成功地制作出不同程度的脊髓损伤较好地反应了脊髓压迫患者的基本伤情及特点。该方法优点为闭合性损伤,持续时间可控,重复性好,可准确制作轻、中、重不同程度SCI模型,特别适用于药物及减压手术的治疗研究。
V nicky等1通过T椎弓钻孔将 Fogarty导管插入大鼠T水平硬膜外间隙,改变注入水量制作不同程度损伤作者认为注水量为15μ对研究SI的病理生理及治疗的保护作用效果最佳。 Sheng等将硅酮管垂直于脊柱纵轴置于T硬膜外间隙,根据硅管保留时间不同造成不同程度的损伤。
2.3脊髓橫断损伤模型横断模型多为切割伤,主要用于sCI再生与修复等研究。该方法多采用锐利刀片横断或半横断脊髓,或切除脊髓部分节段、或吸除部分组织造成脊髓横断性缺损完全横断模型适合轴突再生和功能恢复的评价。一般认为,脊髓完全横断后,如顺行追踪观察到远端标记轴突,则意味着轴突成功再生,也是动物功能恢复的原因。这种观点受到广泛认可,成为完全横断模型的主要优势,但该观点也面临一定的挑战,因为脊髓全横断动物经过重力辅助后肢平板训练或鞘内注射肾上腺素激动剂后可恢复一定功能,并且减少横断脊髓移位导致的硬膜损伤和成纤维细胞浸润,在不采取任何干预措施的情况下,脊髓全横断的成年小鼠可以部分恢复功能。如果实施特定疗法后,脊髓全横断动物功能均可恢复,再次横断后恢复功能消失,那说明这种恢复是由于下行传导束轴突再生引起的。该模型的主要优点是操作简便、重复性好,造成的功能障碍直接归因于脊髓横断原发损伤,对脊髓损伤修复的研究很有价值;缺点是临床患者很少发生脊髓完全离断,且术后动物死亡率高,护理难度大,不利于慢性损伤再生的研究。
部分横断模型可以选择性切断脊髓,制作轻度神经功能障碍,术后易管理,避免了脊髓全横断所致的高死亡率及膀胱储留等问题,利于长时间实验观察,在脊髓再生的研究中具有重要价值。单侧半切模型可利用健侧作为对照进行病理学及移植再生效应的研究,特别是挖制肢体熟练运动的大鼠红核脊髓束在对侧脊髓背外侧柱中下行,容易完全切断侧并使对侧保持完整。背側半横切模型"则容易切断双侧红核脊髓和中央管背侧皮质脊髓束。但部分横切模型也存在一定问题,如很难区分术后功能改善是由于受损传导路再生还是残余组织功能代偿。
2.4啮齿类动物其它SCI模型
2.4.1脊髓缺血再灌注损伤模型该模型最早用于大型动物SC的研究。大鼠脊髓供血主要来自胸主动脉,可采用左锁骨下动脉分支远端阻断胸主动脉或肾下主动脉的方法制作。该模型具有手术简便、并发症少等优点,主要弊端是与临床SCl相关性差,不易控制SCI程度,重复性较差。
2.4.2光化学损伤模型该模型通过激光照射脊髓特定部位1,静脉注射的光敏剂在激光作用下发生化学反应,造成局部氧自由基堆积,脊髓血管内皮细胞受损,引起血栓,导致脊髓缺血损伤和水肿。该方法避免了侵入性操作,保持了脊髓的完整,但光的热效应对脊髓造成的直接损伤对实验研究有一定影响。光化学损伤后小鼠脊髓无空洞形成,而是形成致密结缔组织,损伤组织病理改变和免疫组化结果与小鼠功能受损程度相一致。
实验模型与临床SCI发生的环境有很大不同,如实验动物SCl是在麻醉条件下进行的,而临床患者使用了多种药物使得神经保护剂研究的药物环境不同,即使同一种模型不同品系的动物所产生的SCI效应也不尽相同-0。但正是动物模型的不断发展和完善促进了人们对SCl病理生理机制研究的逐步深入。需要指出的是不同的模型是针对解决不同的问题而建立的,因此每种模型都有其优缺点,任何一种动物模型都不可能完全再现临床SCI错综复杂的病理生理表现,而恰恰是多种不同的动物模型深化了我们对SCI的理解。在实验过程中,应综合考虑多种影响因素,根据实验目的选择一种或多种动物模型。
