PCR检测技术在犬猫临床诊断中的应用-临床应用
来源：未知 |发布时间：2018-02-03 14:17|点击:次
PCR（Polymerase Chain Reaction）中文名称为聚合酶链式反应，是20世纪80年代发展起来的体外酶促扩增特定DNA片段的技术。它具有特异、敏感、快速、简单的优点，能在实验室条件将特定DNA片段于数小时内扩增105～109倍，因此只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，因此也被称为是“微量证据”。产物经琼脂糖凝胶电泳，可见到预期大小的DNA条带出现，从而可对疾病病原体的基因组片段作出鉴定[1]。PCR检测技术的原理[2]是利用DNA在体外高温时变性会形成单链，低温时引物与单链按照碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
在目前的兽医临床工作中，广泛存在着对一部分病原诊断困难或者不能精确诊断的问题，某些是因为现有的诊断技术灵敏度较低，比如对常见病毒诊断的胶体金技术的诊断试纸，还有一些病原在微量时存在诊断困难的情况，比如小巴贝斯虫等疾病。临床上还有很大一部分病原没有商品化的便捷的试剂商业化生产，这一部分的病原的诊断目前在兽医临床工作上还不能做到在医院内诊断。现在市场上出现的新兴的商业化的诊断服务公司为广大医院的临床诊断工作提供了极大的便利，也极大的提高了医生的临床精确诊断效率和技术水平，是为了兽医临床工作离不开的后援力量。
病例分析
1、犬瘟热病例分析
CDV经由鼻、咽和上呼吸道侵入机体后首先在其附近的淋巴结和扁挑体中增殖，动物表现为最初的体温升高和白细胞减少(主要是淋巴细胞减少)。感染第一周会出现病毒血症，通过血液循环，CDV散布到全身的淋巴器官、骨髓和上皮结构的固有膜，身体的所有分泌物中开始向外排毒[3、4]。因此在病毒感染初期是无法在眼鼻分泌物中采集到病毒的，即便有少量病毒存在，胶体金试纸板也很难检测出正确的结果。这是由于胶体金试纸板上包被的抗体需要和特异抗原结合后再和预先包被的二抗结合才能显示结果[5]，这其中需要的抗原（病毒）量较多。而PCR检测是将抗原进行扩增，只要存在抗原就可以通过特异性引物进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，可见到预期大小的DNA条带出现，从而对病原体的基因组片段作出鉴定。因此，PCR检测技术对于犬瘟热早期诊断具有重要的诊断意义。
2、 犬吉氏巴贝斯虫病例分析
虫体在红细胞内繁殖，破坏红细胞，导致溶血性贫血，并引起黄疸。虫体能够产生一些酶，使动物血液中出现大量的扩血管活性物质，如激肽释放酶、血管活性肠肽等，引起低血压性休克综合征。染虫红细胞和非染虫红细胞大量发生凝集，附着于毛细血管内皮细胞，激活动物的凝血系统，导致血管扩张、淤血，从而引起系统组织器官缺氧性损伤[6]。单从分子层面讲，犬巴贝斯与犬吉氏巴贝斯差别不大，只有个别基因位点的不同，但对于临床治疗来说，吉氏巴贝斯虫病的治疗难度稍高[7]。该病的诊断目前临床中多通过采集病犬外周血制成血涂片，经姬姆萨染色后镜检的方法，方法简便，特异性高，但敏感性较差。对染虫率较高的急性病例检出率较高，而对隐性带虫感染的病例则检出率较低。此外，虫体循环抗原和遗传物质DNA或RNA的检测是对虫体直接观察法的发展，在动物内不论证明有虫体循环抗原存在还是有特异DNA或RNA存在，都能确定是否为感染，其中DNA技术是目前最敏感的诊断方法之一[8]。
3、猫传染性腹膜炎病例分析
猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）属于冠状病毒科冠状病毒属，该病毒的靶细胞是单核细胞及巨噬细胞。致全身损伤，在肝脏的浆膜等处形成大量灰白色的小结节（直径 <1～10mm）。本质是免疫介导的血管及血管周边损伤，白细胞崩解及细胞因子释放导致炎性反应。免疫复合物的沉积以及补体的活化加速这一过程，并导致胸水及腹水的渗出液[9]。在渗出型的状态下，会于体腔的浆膜面造成脓性肉芽肿性血管炎的病灶，而导致体腔内出现渗出液。免疫系统的功能对于FIP的感染扮演着重要的角色，因此任何造成免疫力降低的因素都会影响FIP的感染。
讨论
注射疫苗是预防犬猫病毒性疾病的主要措施，并在疫病防治中发挥了较大的作用。但血清学检测时检测出的抗体很难区别是疫苗免疫还是感染病毒产生的，因此，病原学检测的重要性越来越受到人们的重视。胶体金试纸板虽然可以提供快速诊断，但对于疾病的早期诊断和对抗原要求较高的疾病，则无法提供准确的诊断依据。而对于需要做像做血涂片、粪检的疾病，由于主观性较强，易产生漏检的现象，因此PCR核酸检测可提供了客观的诊断依据。
按照农业部《2013年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》的要求，以及我国现行的宠物疾病诊断国家标准中颁布了《犬细小病毒诊断技术（GB/T27533-2011）》和《犬瘟热诊断技术（GB/T27532-2011）》国家技术标准，明确将犬细小病毒和犬瘟热病毒核酸检测（而非试纸卡检测）作为诊断标准。由此可见，国家对于宠物疾病的诊断也逐渐趋于规范，并制定了相关的国家标准，也说明核酸检测将会在动物疫病的诊断中发挥更为重要的作用。
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